本公開提供了用于在支持物上從細(xì)胞樣品捕獲核酸、在支持物上制備文庫(kù)分子、擴(kuò)增支持物上的文庫(kù)分子以產(chǎn)生核酸模板分子以及分析固定的核酸模板分子，包括對(duì)固定的核酸模板分子進(jìn)行檢測(cè)和/或測(cè)序的組合物和方法。固定的核酸模板分子對(duì)應(yīng)于來自細(xì)胞樣品的核酸。固定的核酸模板分子以類似于細(xì)胞樣品中的空間位置的排列在空間上位于支持物上。

背景技術(shù)：

1、由于不同細(xì)胞內(nèi)的各種分析物水平(例如，基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá))，受試者的組織內(nèi)的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)和/或功能上具有差異。細(xì)胞在組織內(nèi)的特定位置(例如，細(xì)胞相對(duì)于鄰近細(xì)胞的位置或細(xì)胞相對(duì)于組織微環(huán)境的位置)可以影響例如細(xì)胞的形態(tài)、分化、命運(yùn)、活力、增殖、行為和信號(hào)傳導(dǎo)以及與組織中其他細(xì)胞的串?dāng)_。

2、先前已經(jīng)使用僅在完整組織或組織的一部分的背景下提供針對(duì)少量分析物的數(shù)據(jù)或提供針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的大量分析物數(shù)據(jù)但未能提供關(guān)于單個(gè)細(xì)胞在親本生物樣品(例如，組織樣品)中的位置的信息的技術(shù)來研究空間異質(zhì)性。

3、生物樣品內(nèi)分析物的空間分析可能需要確定分析物序列或其互補(bǔ)序列以及空間條形碼的序列或其互補(bǔ)序列，以識(shí)別分析物的位置。生物樣品可以放置在固體支持物上，以在進(jìn)行分析以識(shí)別或表征樣品內(nèi)的分析物(諸如dna、rna或其他遺傳物質(zhì))時(shí)改進(jìn)特異性和效率。需要改進(jìn)支持物上核酸的空間分辨表面捕獲以及下游組裝和測(cè)序技術(shù)，其降低獲得空間序列信息所需的組裝、時(shí)間和/或計(jì)算要求。本文提供了滿足這種需要的組合物、裝置和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個(gè)方面，本公開提供了一種用于制備空間分辨核酸的方法，該方法包括：a)提供支持物，該支持物包括：(i)包含至少一種親水性聚合物的低非特異性結(jié)合涂層，其中該低非特異性結(jié)合涂層具有不超過45度的水接觸角；和(ii)共價(jià)拴系至低非特異性結(jié)合涂層的多個(gè)固定的表面捕獲引物，其中每個(gè)單獨(dú)的表面捕獲引物包含通用表面捕獲引物序列(110)、針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(120)和rna捕獲序列；b)在適合于細(xì)胞樣品保持在經(jīng)涂覆的支持物上的固定位置的條件下將細(xì)胞樣品定位在經(jīng)涂覆的支持物上，破壞細(xì)胞樣品，在適合于保存來自細(xì)胞樣品的rna分子的空間位置信息的條件下釋放細(xì)胞樣品的多個(gè)rna分子，以及在適合于使單獨(dú)的rna分子與單獨(dú)的固定的表面捕獲引物雜交以產(chǎn)生多個(gè)捕獲引物-rna雙鏈體的條件下收集支持物的多個(gè)固定的表面捕獲引物上的多個(gè)rna分子，其中每個(gè)引物-rna雙鏈體包含與rna分子雜交的固定的表面捕獲引物；c)在適合于延伸固定的表面捕獲引物的3'端的條件下并使用雜交的rna作為模板鏈，在適合于在3'端處產(chǎn)生非模板polyc尾的條件下，在經(jīng)涂覆的支持物上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由此產(chǎn)生在3'端'處具有非模板polyc尾的多個(gè)第一鏈cdna分子，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括多個(gè)模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸，其中模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸中的每個(gè)模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸包含能夠與第一鏈cdna分子的非模板polyc尾雜交的polyg區(qū)、針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(130)和針對(duì)表面釘扎引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(140)；d)從多個(gè)第一鏈cdna分子的非模板polyc尾的3'末端并且使用模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸作為模板鏈進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，由此產(chǎn)生多個(gè)固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna，其中每個(gè)全長(zhǎng)第一鏈cdna包含：通用表面捕獲引物序列(110)；針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(120)；rna捕獲序列；cdna插入?yún)^(qū)；polyc尾區(qū)；針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(130)；以及針對(duì)表面釘扎引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(140)；e)移除rna分子，同時(shí)保留多個(gè)固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna；f)在適合于使單獨(dú)的環(huán)化寡核苷酸與固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna雜交的條件下使多個(gè)保留的固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna與多個(gè)單鏈環(huán)化寡核苷酸接觸，由此形成具有間隙的單鏈環(huán)狀分子，其中單獨(dú)的單鏈環(huán)化寡核苷酸包含：(i)與針對(duì)反向測(cè)序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(120)互補(bǔ)的序列，(ii)與通用表面捕獲引物序列(110)互補(bǔ)的序列，(iii)接頭區(qū)，(iv)與針對(duì)表面釘扎引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(140)互補(bǔ)的序列，(v)以及與針對(duì)正向測(cè)序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(130)互補(bǔ)的序列；g)使用固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna的polyc尾區(qū)、cdna插入?yún)^(qū)和rna捕獲序列作為模板鏈來進(jìn)行聚合酶催化的延伸反應(yīng)以填充間隙，其中聚合酶催化的延伸反應(yīng)形成具有切口的單鏈環(huán)化分子，并且其中切口通過進(jìn)行酶促連接反應(yīng)而閉合以產(chǎn)生與固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna雜交的單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀分子；h)使用固定的全長(zhǎng)第一鏈cdna的末端3'端作為起始位點(diǎn)以及共價(jià)閉合環(huán)狀分子作為模板鏈進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，由此產(chǎn)生在支持物上空間分辨的多個(gè)固定的核酸串聯(lián)體；i)對(duì)多個(gè)單獨(dú)的固定的核酸串聯(lián)體進(jìn)行測(cè)序，其中測(cè)序包括單獨(dú)的核酸串聯(lián)體的cdna插入?yún)^(qū)的至少一部分，這些單獨(dú)的核酸串聯(lián)體對(duì)應(yīng)于從細(xì)胞樣品洗脫的單獨(dú)的rna分子；以及j)確定單獨(dú)的核酸串聯(lián)體在經(jīng)涂覆的支持物上的位置，這些位置對(duì)應(yīng)于從細(xì)胞樣品洗脫的單獨(dú)的rna分子的空間位置。

2、在一些實(shí)施例中，步驟b)的細(xì)胞樣品包括單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞、組織、器官、生物體或切片的細(xì)胞樣品。在一些實(shí)施例中，步驟b)的細(xì)胞樣品包括新鮮樣品、冷凍樣品、新鮮冷凍樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。

3、在一些實(shí)施例中，步驟c)的多個(gè)模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸包括嵌合dna和/或rna寡核苷酸。

4、在一些實(shí)施例中，步驟f)的單鏈環(huán)化寡核苷酸的接頭區(qū)包含用于多重化的至少一個(gè)樣品索引序列、用于分子標(biāo)記的至少一個(gè)唯一分子索引(umi)序列和/或針對(duì)壓實(shí)寡核苷酸的至少一個(gè)通用結(jié)合位點(diǎn)。

5、在一些實(shí)施例中，步驟h)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)在多個(gè)壓實(shí)寡核苷酸的存在下進(jìn)行，其中壓實(shí)寡核苷酸包括單鏈寡核苷酸，這些單鏈寡核苷酸各自在第一遠(yuǎn)側(cè)端處具有與串聯(lián)體分子的一個(gè)部分雜交的第一區(qū)并且在第二遠(yuǎn)側(cè)端處具有與同一串聯(lián)體分子的第二部分雜交的第二區(qū)，其中串聯(lián)體分子的第一部分和串聯(lián)體分子的第二部分接近，由此導(dǎo)致串聯(lián)體分子的壓實(shí)以形成dna納米球。

6、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測(cè)序包括：a.使多個(gè)串聯(lián)體分子與多個(gè)測(cè)序聚合酶和多個(gè)核酸測(cè)序引物接觸，其中該接觸在適合于形成多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶的條件下進(jìn)行，其中每個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶包含結(jié)合至核酸雙鏈體的測(cè)序聚合酶，并且其中核酸雙鏈體包含與核酸測(cè)序引物雜交的串聯(lián)體分子的一部分；b.使多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶與多個(gè)經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸接觸，該多個(gè)經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的核苷酸在2'糖位置或3'糖位置處包含阻斷部分，其中該接觸在適合于將至少一個(gè)核苷酸與復(fù)合測(cè)序聚合酶中的至少一個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，并且其中該條件適合于促進(jìn)聚合酶催化的核苷酸摻入；c.將核苷酸摻入至少一個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶的測(cè)序引物的3'端；d.檢測(cè)經(jīng)摻入的核苷酸并且識(shí)別該經(jīng)摻入的核苷酸的核堿基；e.從經(jīng)摻入的核苷酸中移除阻斷部分；以及f.重復(fù)步驟b.至e.至少一次。

7、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測(cè)序包括：a.使多個(gè)串聯(lián)體分子與多個(gè)測(cè)序聚合酶和多個(gè)核酸測(cè)序引物接觸，其中該接觸在適合于形成多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶的條件下進(jìn)行，其中每個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶包含結(jié)合至核酸雙鏈體的測(cè)序聚合酶，并且其中核酸雙鏈體包含與核酸測(cè)序引物雜交的串聯(lián)體分子的一部分；b.使多個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸，該多個(gè)核苷酸各自包含附接至磷酸酯鏈的磷酸酯部分的可檢測(cè)標(biāo)記，其中該接觸在適合于將至少一個(gè)核苷酸與復(fù)合測(cè)序聚合酶中的至少一個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，并且其中該條件適合于促進(jìn)聚合酶催化的核苷酸摻入；c.將核苷酸摻入至少一個(gè)復(fù)合測(cè)序聚合酶的測(cè)序引物的3'端；d.檢測(cè)經(jīng)摻入的核苷酸并且識(shí)別該經(jīng)摻入的核苷酸的核堿基；以及e.重復(fù)步驟b.至d.至少一次。

8、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測(cè)序包括：a.使多個(gè)串聯(lián)體分子與多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和多個(gè)核酸測(cè)序引物接觸，其中該接觸在適合于將多個(gè)第一聚合酶與多個(gè)核酸模板分子和多個(gè)核酸引物結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個(gè)第一復(fù)合聚合酶，其中每個(gè)第一復(fù)合聚合酶包含結(jié)合至核酸雙鏈體的第一聚合酶，其中核酸雙鏈體包含與核酸引物雜交的核酸模板分子；b.使多個(gè)第一復(fù)合聚合酶與多個(gè)經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子接觸以形成多個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，其中多個(gè)經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子中的單獨(dú)的經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子包括附接至多個(gè)核苷酸臂的核，并且其中每個(gè)核苷酸臂附接至核苷酸單元，其中該接觸在適合于將多價(jià)分子的互補(bǔ)核苷酸單元與多個(gè)第一復(fù)合聚合酶中的至少兩個(gè)第一復(fù)合聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，并且其中該條件適合于抑制互補(bǔ)核苷酸單元摻入到多個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的引物中；c.檢測(cè)多個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物；以及d.識(shí)別多個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物中的互補(bǔ)核苷酸單元的核堿基，由此確定核酸模板分子的序列。

9、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測(cè)序包括：a.通過移除多個(gè)第一測(cè)序聚合酶及其結(jié)合的多價(jià)分子并保留多個(gè)核酸雙鏈體來解離多個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物；b.在適合于將多個(gè)第二聚合酶與多個(gè)保留的核酸雙鏈體結(jié)合的條件下使步驟e)的多個(gè)保留的核酸雙鏈體與多個(gè)第二測(cè)序聚合酶接觸，由此形成各自包含結(jié)合至核酸雙鏈體的第二聚合酶的多個(gè)第二復(fù)合聚合酶；以及c.使多個(gè)第二復(fù)合聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸，其中該接觸在適合于將來自多個(gè)核苷酸的互補(bǔ)核苷酸與第二復(fù)合聚合酶中的至少兩個(gè)第二復(fù)合聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個(gè)核苷酸結(jié)合復(fù)合物，并且其中該條件適合于促進(jìn)結(jié)合的互補(bǔ)核苷酸摻入到核苷酸結(jié)合復(fù)合物的引物中。

10、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：d.檢測(cè)摻入到核苷酸復(fù)合聚合酶的引物中的互補(bǔ)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：d.檢測(cè)摻入到核苷酸復(fù)合聚合酶的引物中的互補(bǔ)核苷酸；以及e.識(shí)別摻入到核苷酸復(fù)合聚合酶的引物中的互補(bǔ)核苷酸的核堿基。

11、在一些實(shí)施例中，其中步驟b.的使多個(gè)第一復(fù)合聚合酶與多個(gè)多價(jià)分子接觸在抑制聚合酶催化的核苷酸摻入的非催化二價(jià)陽離子的存在下進(jìn)行，其中非催化二價(jià)陽離子包括鍶、鋇或鈣。

12、在一些實(shí)施例中，多個(gè)多價(jià)分子中的單獨(dú)的多價(jià)分子包含：(a)核；和(b)多個(gè)核苷酸臂，該多個(gè)核苷酸臂包含：(i)核附接部分，(ii)間隔區(qū)，(iii)接頭和(iv)核苷酸單元，其中核經(jīng)由多個(gè)核苷酸臂的核附接部分附接至該多個(gè)核苷酸臂，其中間隔區(qū)附接至接頭，并且其中接頭附接至核苷酸單元。

13、在一些實(shí)施例中，接頭包含具有2至6個(gè)亞基的脂族鏈或具有2至6個(gè)亞基的低聚乙二醇鏈。

14、在一些實(shí)施例中，其中附接至給定核的多個(gè)核苷酸臂具有相同類型的核苷酸單元，并且其中這些類型的核苷酸單元包括datp、dgtp、dctp、dttp或dutp。

15、在一些實(shí)施例中，多個(gè)多價(jià)分子包括一種類型的多價(jià)分子，其中多個(gè)多價(jià)分子中的每個(gè)多價(jià)分子具有選自由以下項(xiàng)組成的組的相同類型的核苷酸單元：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。在一些實(shí)施例中，多個(gè)多價(jià)分子包括兩種或更多種類型的多價(jià)分子的任意組合的混合物，每種類型具有選自由以下項(xiàng)組成的組的核苷酸單元：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。

16、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括形成多個(gè)結(jié)合復(fù)合物，包括以下步驟：a)將第一核酸測(cè)序引物、第一測(cè)序聚合酶和第一多價(jià)分子與串聯(lián)體分子的第一部分結(jié)合，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第一核苷酸單元結(jié)合至第一聚合酶；以及b)將第二核酸測(cè)序引物、第二測(cè)序聚合酶和第一多價(jià)分子與同一串聯(lián)體分子的第二部分結(jié)合，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價(jià)分子的第二核苷酸單元與第二聚合酶結(jié)合，其中包括同一多價(jià)分子的第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物形成親合力復(fù)合物。

17、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括形成親合力復(fù)合物，包括以下步驟：a)使多個(gè)第一測(cè)序聚合酶和多個(gè)核酸測(cè)序引物與串聯(lián)體核酸模板分子的不同部分接觸，以在同一串聯(lián)體分子上形成至少第一復(fù)合聚合酶和第二復(fù)合聚合酶；以及b)在適合于將來自多個(gè)多價(jià)分子的單個(gè)多價(jià)分子與第一復(fù)合聚合酶和第二復(fù)合聚合酶結(jié)合的條件下，使多個(gè)經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的多價(jià)分子與同一串聯(lián)體分子上的至少第一復(fù)合聚合酶和第二復(fù)合聚合酶接觸，其中單個(gè)多價(jià)分子的至少第一核苷酸單元結(jié)合至第一復(fù)合聚合酶，該第一復(fù)合聚合酶包括與串聯(lián)體分子的第一部分雜交的第一引物，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，并且其中單個(gè)多價(jià)分子的至少第二核苷酸單元結(jié)合至第二復(fù)合聚合酶，該第二復(fù)合聚合酶包括與串聯(lián)體分子的第二部分雜交的第二引物，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中接觸在適合于抑制結(jié)合的第一核苷酸單元和第二核苷酸單元經(jīng)聚合酶催化摻入第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物中的條件下進(jìn)行，并且其中結(jié)合至同一多價(jià)分子的第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物形成親合力復(fù)合物；c)檢測(cè)同一串聯(lián)體分子上的第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物；以及d)識(shí)別第一結(jié)合復(fù)合物中的第一核苷酸單元，由此確定串聯(lián)體分子的第一部分的序列，并且識(shí)別第二結(jié)合復(fù)合物中的第二核苷酸單元，由此確定串聯(lián)體分子的第二部分的序列。

18、在一些實(shí)施例中，其中步驟c.的使多個(gè)第二復(fù)合聚合酶與多個(gè)核苷酸接觸在促進(jìn)聚合酶催化的核苷酸摻入的催化二價(jià)陽離子的存在下進(jìn)行，其中催化二價(jià)陽離子包括鎂或錳。

19、在一些實(shí)施例中，步驟c.中的多個(gè)核苷酸中的單獨(dú)的核苷酸包含芳香族堿基、五碳糖和1至10個(gè)磷酸酯基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，步驟c.的多個(gè)核苷酸包括選自由以下項(xiàng)組成的組的一種類型的核苷酸：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp，或包括選自由以下項(xiàng)組成的組的兩種或更多種類型的核苷酸的任意組合的混合物：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。

20、在一些實(shí)施例中，步驟c.中的多個(gè)核苷酸中的核苷酸中的至少一個(gè)核苷酸用熒光團(tuán)標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，步驟c.中的多個(gè)核苷酸缺乏熒光團(tuán)標(biāo)記。

21、在一些實(shí)施例中，步驟c.的多個(gè)核苷酸中的核苷酸中的至少一個(gè)核苷酸包含附接至糖基團(tuán)的3'碳位置的可移除鏈終止部分，其中可移除鏈終止部分包括烷基基團(tuán)、烯基基團(tuán)、炔基基團(tuán)、烯丙基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、芐基基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、o-疊氮甲基基團(tuán)、胺基基團(tuán)、酰胺基基團(tuán)、酮基基團(tuán)、異氰酸酯基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、硫代基團(tuán)、二硫基團(tuán)、碳酸酯基團(tuán)、脲基團(tuán)或甲硅烷基基團(tuán)，并且其中可移除鏈終止部分可用化學(xué)化合物裂解以在糖基團(tuán)上產(chǎn)生可延伸3'oh部分。