本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物基化合物、特別是使用重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)鳶尾酮化合物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1、植物天然產(chǎn)物（pnp）是非營養(yǎng)性、生物活性化合物，被廣泛用作藥物、化學(xué)品、調(diào)味劑和香精。這些化合物從植物生物質(zhì)中提取，其供應(yīng)需要在土地、水和時間方面進(jìn)行大量投資，并且往往有限。此外，pnp經(jīng)常以豐度較低存在于植物中，這使得它們無法滿足研究和市場需求。一些pnp可以化學(xué)合成，然而，通過大規(guī)模合成獲得結(jié)構(gòu)復(fù)雜、對映體純的生物活性pnp通常是一個挑戰(zhàn)。
2、合成生物學(xué)和代謝工程的最新發(fā)展使得在快速生長且可發(fā)酵的微生物中生產(chǎn)pnp成為可能。這一策略是獲取高價值分子的最有前景的替代方案之一，它繞過了植物生物質(zhì)供應(yīng)有限和不穩(wěn)定的問題。為此，將全部或部分植物生物合成途徑轉(zhuǎn)移到工程化微生物底盤例如釀酒酵母（saccharomyces?cerevisiae）或大腸埃希氏桿菌（escherichia?coli）中，能夠異源生產(chǎn)最終的pnp或其生物合成中間體，用于下游化學(xué)合成。使用這種方法的成功實例包括半合成青蒿素（paddon等，nat.?rev.?microbiol.?12?(2014)?355–367）、玫瑰油（kutyna等，genes?2018,?9(7),?326）和白藜蘆醇（li等，scientific?reports,?2016,volume?6，文章編號：36827）的生產(chǎn)。然而，在許多情況下，植物中的天然生物合成途徑仍然完全或部分未知。因此，異源生產(chǎn)需要從頭設(shè)計新的途徑或使用替代酶來彌補缺失的步驟。
3、鳶尾油是香水中使用的最昂貴的天然產(chǎn)品之一，價格超過140000歐元/kg。盡管價格很高，但由于生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低，對農(nóng)民來說沒有足夠的激勵，全球鳶尾油的產(chǎn)量正在下降。鳶尾酮是鳶尾油的活性化合物，造成其紫羅蘭般的氣味和脂粉香調(diào)。在新鮮鳶尾提取物中以不同比例天然存在鳶尾酮的五種立體異構(gòu)體/對映異構(gòu)體。順-α-、β-和γ-鳶尾酮在大多數(shù)情況下都存在，而反-α-和γ-鳶尾酮則罕見。鳶尾油的氣味和價格由不同鳶尾酮之間的比率決定。
4、由于存在兩個手性中心，鳶尾酮單一對映體的化學(xué)合成具有挑戰(zhàn)性，并且報道很少。商業(yè)化irone?alpha?主要由α-鳶尾酮的非對映異構(gòu)體組成，并存在少量β-鳶尾酮。所述合成涉及甲基-3-假紫羅蘭酮的酸催化環(huán)化。從上述irone?alpha?開始，開發(fā)了一種生物催化劑輔助程序，可提供鳶尾酮的所有十種異構(gòu)體（brenna等，helvetica?chimica?acta?,2001,?84(12):3650-3666）。然而，這個過程很長，并且需要幾個外消旋混合物的脂肪酶介導(dǎo)的拆分和非對映異構(gòu)體產(chǎn)物的分離，不適合于工業(yè)生產(chǎn)。最近的一項研究報告了(-)-(2s,6r)-順-α-和(-)-(2s,6r)-順-γ-鳶尾酮的具有挑戰(zhàn)性的從頭對映選擇性合成（bugoni等，chemistry,?2015?jan?7;21(2):791-9）?；瘜W(xué)合成中的困難凸顯了人們對通過合成生物學(xué)開發(fā)鳶尾酮生產(chǎn)程序的興趣。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明人在此證明，可以在重組微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)鳶尾酮生物合成途徑，從而產(chǎn)生α-鳶尾酮和/或β-鳶尾酮。
2、因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)鳶尾酮化合物的方法，所述方法包括將包含編碼催化2-甲基-番茄紅素的一個或兩個末端的β-或?-環(huán)化和/或2,2’-二甲基-番茄紅素的一個或兩個末端的β-或?-環(huán)化的番茄紅素環(huán)化酶的異源核酸的重組微生物宿主細(xì)胞在適合于生產(chǎn)所述鳶尾酮化合物的條件下培養(yǎng)，并任選地回收所述鳶尾酮化合物。
3、所述番茄紅素環(huán)化酶可以選自野生型藍(lán)藻crtl型番茄紅素?-環(huán)化酶、野生型細(xì)菌crty型番茄紅素β-環(huán)化酶和革蘭氏陽性細(xì)菌的野生型異二聚體型番茄紅素環(huán)化酶及其變體，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性并與這些環(huán)化酶中的任一者具有至少70%的序列同一性。優(yōu)選地，所述番茄紅素環(huán)化酶可以包含選自seq?id?no：10、8、9、11、1、2和3及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性，并與seqid?no：10、8、9、11、1、2和3中的任一者具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
4、具體而言，所述番茄紅素環(huán)化酶可以包含選自seq?id?no：8至11及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：8至11中的任一者具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。優(yōu)選地，所述番茄紅素環(huán)化酶包含選自seq?id?no：10及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：10具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
5、可選地，所述番茄紅素環(huán)化酶可以包含選自seq?id?no：1至3及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素β-環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：1至3中的任一者具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
6、優(yōu)選地，所述重組微生物宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼香葉基焦磷酸（gpp）c6-甲基轉(zhuǎn)移酶的異源核酸。具體而言，所述gpp?c6-甲基轉(zhuǎn)移酶可以包含選自seq?id?no：17至31及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出gpp?c6-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并與seq?id?no：17至31具有至少70%的序列同一性。
7、所述重組微生物宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步包含編碼法尼基二磷酸（fpp）合酶的異源核酸和/或編碼香葉基香葉基二磷酸（ggpp）合酶的異源核酸和/或編碼表現(xiàn)出fpp合酶和ggpp合酶活性的多肽的異源核酸；和/或編碼八氫番茄紅素合酶的異源核酸；和/或編碼形成番茄紅素的八氫番茄紅素去飽和酶的異源核酸；和/或編碼切割類胡蘿卜素的雙加氧酶的異源核酸。
8、所述重組微生物宿主可能已被遺傳修飾，以與未修飾的微生物宿主細(xì)胞相比降低內(nèi)源pgpb磷酸酶、內(nèi)源cpdb磷酸酶和/或內(nèi)源metj阻遏蛋白的活性。
9、優(yōu)選地，所述重組微生物宿主是細(xì)菌或酵母。
10、在第二方面，本發(fā)明還涉及如上所定義的重組微生物宿主。
11、在另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重組微生物宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)鳶尾酮化合物的用途。
1.一種生產(chǎn)鳶尾酮化合物的方法，所述方法包括將包含編碼催化2-甲基-番茄紅素的一個或兩個末端的β-或?-環(huán)化和/或2,2’-二甲基-番茄紅素的一個或兩個末端的β-或?-環(huán)化的番茄紅素環(huán)化酶的異源核酸的重組微生物宿主細(xì)胞在適合于生產(chǎn)所述鳶尾酮化合物的條件下培養(yǎng)，并任選地回收所述鳶尾酮化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述番茄紅素環(huán)化酶選自野生型藍(lán)藻crtl型番茄紅素?-環(huán)化酶、野生型細(xì)菌crty型番茄紅素β-環(huán)化酶和革蘭氏陽性細(xì)菌的野生型異二聚體型番茄紅素環(huán)化酶及其變體，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性并與這些環(huán)化酶中的任一者具有至少70%的序列同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述番茄紅素環(huán)化酶包含選自seq?id?no：10、8、9、11、1、2和3及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：10、8、9、11、1、2和3中的任一者具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述番茄紅素環(huán)化酶包含選自seq?idno：8至11及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：8至11中的任一者具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述番茄紅素環(huán)化酶包含選自seq?idno：10及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：10具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述番茄紅素環(huán)化酶包含選自seq?idno：1至3及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出番茄紅素β-環(huán)化酶活性，并與seq?id?no：1至3中的任一者具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述重組微生物宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼香葉基焦磷酸（gpp）c6-甲基轉(zhuǎn)移酶的異源核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述gpp?c6-甲基轉(zhuǎn)移酶包含選自seq?id?no：17至31及其變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述變體表現(xiàn)出gpp?c6-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并與seq?id?no：17至31具有至少70%的序列同一性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述重組微生物宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼法尼基二磷酸（fpp）合酶的異源核酸和/或編碼香葉基香葉基二磷酸（ggpp）合酶的異源核酸和/或編碼表現(xiàn)出fpp合酶和ggpp合酶活性的多肽的異源核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述重組微生物宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼八氫番茄紅素合酶的異源核酸和編碼形成番茄紅素的八氫番茄紅素去飽和酶的異源核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述重組微生物宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼切割類胡蘿卜素的雙加氧酶的異源核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述重組微生物宿主已被遺傳修飾，以與未修飾的微生物宿主細(xì)胞相比降低內(nèi)源pgpb磷酸酶、內(nèi)源cpdb磷酸酶和/或內(nèi)源metj阻遏蛋白的活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述重組微生物宿主是細(xì)菌或酵母。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所定義的重組微生物宿主。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組微生物宿主細(xì)胞的用途，其用于生產(chǎn)鳶尾酮化合物。