本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種治療糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，其主要特征是血糖水平長(zhǎng)期升高，可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，如心血管疾病、腎臟疾病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。當(dāng)前糖尿病治療手段多樣，但都存在局限性。藥物治療方面，口服降糖藥如磺脲類(lèi)、雙胍類(lèi)等雖能在一定程度上控制血糖，但長(zhǎng)期使用易出現(xiàn)藥物耐受性，療效下降，還可能產(chǎn)生低血糖、胃腸道不適等副作用。胰島素注射雖能有效補(bǔ)充胰島素，但需嚴(yán)格控制劑量和注射時(shí)間，頻繁注射給患者帶來(lái)極大不便，且長(zhǎng)期使用也無(wú)法阻止胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)一步衰退。胰島移植是一種較為有效的治療方式，但由于供體器官稀缺，免疫排斥反應(yīng)難以避免，需要長(zhǎng)期使用免疫抑制劑，增加了感染和其他并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)因其獨(dú)特生物學(xué)特性，成為糖尿病治療研究的熱點(diǎn)。mscs具有多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下，可分化為胰島素分泌細(xì)胞，補(bǔ)充受損的胰島β細(xì)胞，重建胰島素分泌功能。同時(shí)，mscs還能通過(guò)旁分泌作用分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)內(nèi)源性胰島β細(xì)胞的修復(fù)與再生，為糖尿病治療提供新途徑。盡管間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖尿病展現(xiàn)出巨大潛力，但目前臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。其中，如何制備安全、有效、穩(wěn)定且標(biāo)準(zhǔn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑是關(guān)鍵問(wèn)題。不同來(lái)源、不同制備方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞活性、純度、生物學(xué)功能等方面存在差異，影響治療效果的一致性和可靠性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種治療糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑及其制備方法。
2、本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
3、一種治療糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，包括以下組分：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、柚皮苷@sio2。
4、進(jìn)一步地，所述柚皮苷@sio2的制備原料，包括以下重量份的組分：正硅酸乙酯(teos)?10-15份、3-巰丙基氧基硅烷(mptms)?4-6份、柚皮苷2-3份、丁二酸酐0.8-1.2份、半胱胺鹽酸鹽2-3份。
5、進(jìn)一步地，所述柚皮苷@sio2的制備方法，包括以下步驟：
6、a1：將ctab、1?mol/l氫氧化鈉溶液、20-25vol%乙醇水溶液混合，300w超聲分散20-30?min，升溫至60-70℃，以0.1?ml/min的速率滴加teos與mptms，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)2-3h，冷卻至室溫，8000-9000?rpm離心10-15?min，沉淀用去離子水洗滌，真空干燥，分散在無(wú)水乙醇和37%鹽酸的混合溶液中加熱回流24?h，8000-9000?pm離心10-15?min，沉淀用去離子水洗滌，真空干燥，得到改性多孔二氧化硅；
7、a2：將柚皮苷和丁二酸酐分別溶解于吡啶中，攪拌下將丁二酸酐溶液緩慢滴加到柚皮苷溶液中，35℃水浴反應(yīng)14-16?h，去離子水透析2天，每4?h更換1次透析液，冷凍干燥，得到丁二酸柚皮苷酯；
8、a3：取步驟a3所得丁二酸柚皮苷酯溶解于dmf中，滴加nhs/edci水溶液，攪拌2?h，調(diào)節(jié)ph在4.8-4.9，加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和半胱胺鹽酸鹽，35℃攪拌8?h，過(guò)程中調(diào)ph在4.8-4.9，用0.008?m?hcl避光透析24?h，沉淀用0.008?m?hcl洗滌，-40℃冷凍干燥，得到改性柚皮苷；
9、a4：取步驟a3所得改性柚皮苷與步驟a1所得改性多孔二氧化硅加入去離子水中混勻，室溫下150-200?rpm攪拌1-2?h，加入dmso，繼續(xù)攪拌4-5?h，10000?rpm離心8-12?min，沉淀用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌，真空干燥，得到柚皮苷@sio2。
10、進(jìn)一步地，步驟a1中，所述ctab、1?mol/l氫氧化鈉溶液、30vol%乙醇水溶液與teos的用量比為1?g:7?ml:150?ml:5?g。
11、進(jìn)一步地，步驟a1中，所述無(wú)水乙醇和37%鹽酸的混合溶液中乙醇與鹽酸的體積比為10-12:1。
12、進(jìn)一步地，步驟a2中，所述柚皮苷在吡啶中的質(zhì)量濃度為200?mg/ml。
13、進(jìn)一步地，步驟a2中，所述丁二酸酐在吡啶中的質(zhì)量濃度為80?mg/ml。
14、進(jìn)一步地，步驟a3中，所述丁二酸柚皮苷酯在dmf中的質(zhì)量濃度為20?mg/ml。
15、進(jìn)一步地，步驟a3中，所述nhs/edci水溶液中nhs和edci的質(zhì)量濃度分別為10?mg/ml和25?mg/ml。
16、進(jìn)一步地，步驟a3中，所述nhs與半胱胺鹽酸鹽的質(zhì)量比為2:1。
17、進(jìn)一步地，步驟a3中，所述tcep與半胱胺鹽酸鹽的質(zhì)量比為0.8-1.2:1。
18、進(jìn)一步地，步驟a4中，所述改性多孔二氧化硅在去離子水中的質(zhì)量濃度為5-8?mg/ml。
19、進(jìn)一步地，步驟a4中，所述dmso與去離子水的體積比為1:5。
20、進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了所述治療糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：
21、s1：將金銀花于pbs溶液中浸泡20-30?min，高速勻漿機(jī)均質(zhì)，用醫(yī)用無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液4℃過(guò)夜，在4℃條件下依次進(jìn)行1000g×10min、2000g×20min、5000g×60min、10000g×60min梯度離心，過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液100000g×60?min離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸至20μg/ml，得到金銀花外泌體重懸液；
22、s2：按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucmsc)的分離培養(yǎng)和傳代，取p4代hucmsc接種至六孔板中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，2.5?ml完全培養(yǎng)基，37℃、5%?co2培養(yǎng)24?h，吸除舊的培養(yǎng)基，加入2?ml金銀花外泌體重懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24?h；
23、s3：步驟s2培養(yǎng)24?h后，收集hucmsc，用pbs重懸至密度為106個(gè)/ml，加入柚皮苷@sio2至濃度為10?mg/ml，200-300?rpm攪拌30?min，得到一種治療糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。
24、進(jìn)一步地，所述完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmed/f12培養(yǎng)基。
25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
26、本發(fā)明提供了一種治療糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，通過(guò)構(gòu)建巰基功能化介孔二氧化硅載體與巰基修飾的柚皮苷復(fù)合體系，結(jié)合金銀花外泌體預(yù)處理的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，多組分協(xié)同增效，強(qiáng)化抗炎與胰島保護(hù)作用。本發(fā)明采用ctab模板法結(jié)合巰基硅烷偶聯(lián)劑對(duì)二氧化硅進(jìn)行表面功能化，形成了具有有序介孔結(jié)構(gòu)的改性多孔二氧化硅，該載體通過(guò)引入巰基活性位點(diǎn)，與后續(xù)改性的柚皮苷形成共價(jià)鍵結(jié)合，提升包封率。本發(fā)明利用羥基化合物與酸酐具有反應(yīng)活性好，接枝率高，反應(yīng)過(guò)程易控制等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)丁二酸酐酯化反應(yīng)對(duì)柚皮苷進(jìn)行羧基修飾，不改變柚皮苷藥理活性的基礎(chǔ)上利用其糖苷部位的羥基與酸酐的反應(yīng)引入易于反應(yīng)的活性基團(tuán)，再與半胱胺鹽酸鹽形成共價(jià)鍵，通過(guò)半胱胺分子中的氨基與丁二酸柚皮苷酯分子中的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，制備出含有巰基活性基團(tuán)的改性柚皮苷，與改性多孔二氧化硅形成二硫鍵，將藥物通過(guò)物理吸附、氫鍵相互作用以及共價(jià)鍵負(fù)載在載體上，通過(guò)化學(xué)改性手段構(gòu)建了具多重鍵合作用的復(fù)合載體體系，控制藥物的釋放速度，顯著提升藥物負(fù)載效率及緩釋性能，有效延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。本發(fā)明通過(guò)通過(guò)金銀花外泌體預(yù)處理與藥物載體的雙重調(diào)控，形成了多靶點(diǎn)治療體系，通過(guò)使用金銀花外泌體與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucmscs)共培養(yǎng)，顯著提高了hucmscs的細(xì)胞增殖率，有效促進(jìn)了hucmscs的增殖，提高了hucmscs的活性，有利于提高制劑療效，結(jié)合柚皮苷@sio2，在糖尿病模型小鼠中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎效果，通過(guò)促進(jìn)β細(xì)胞再生，使胰島β細(xì)胞占比恢復(fù)至正常水平。