本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)，具體涉及一種柱前衍生液相色譜法測(cè)定青霉胺對(duì)映異構(gòu)體含量的方法。

背景技術(shù)：

1、青霉胺（penicillamine,pa）化學(xué)名為2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸(2-amino-3-mercapto-3-methylbutanoic?acid)，分子式是c5h11no2s，分子中含有一個(gè)手性碳原子，是一種具有光學(xué)活性的物質(zhì)，具有dl-型（cas?no.52-66-4）、d-型（cas?no.52-67-5）和l-型（cas?no.?1113-41-3），其結(jié)構(gòu)如下所示：

2、?

3、dl-青霉胺?????????????????d-青霉胺????????????l-青霉胺

4、目前用于臨床的青霉胺片是d-青霉胺，即d-3-巰基纈氨酸，類別為重金屬解毒藥，為國(guó)家基本藥物。適用于重金屬中毒、肝豆?fàn)詈俗冃裕╳ilson?。?、胱氨酸尿及其結(jié)石，亦治療其他藥物無(wú)效的嚴(yán)重活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性活動(dòng)性肝炎等。l-青霉胺是青霉素類抗生素中的一種代謝物，獨(dú)特的毒理學(xué)特性，其對(duì)吡哆醛-5’-磷酸(plp)依賴酶的強(qiáng)抑制作用，導(dǎo)致動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)神經(jīng)毒性，會(huì)引發(fā)神經(jīng)炎，還可能導(dǎo)致骨髓損傷，視覺(jué)下降，還可能導(dǎo)致腎臟受損、骨組織損傷、嗅覺(jué)受損和癌癥，因此未被臨床應(yīng)用。

5、隨著對(duì)青霉胺的進(jìn)一步研究，除了發(fā)現(xiàn)d-青霉胺有治療慢性侵略性肝炎和鞏膜潰瘍、胺對(duì)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜疾病也有預(yù)防作用等新的治療跡象外，抗真菌活性、抗癌藥物、預(yù)防糖化作用和其他因素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和dna疾病等。l-青霉胺的藥用價(jià)值逐漸被挖掘，其地位越來(lái)越重要，可作為痙攣和驚厥的誘導(dǎo)劑，能夠顯著減輕過(guò)氧亞硝酸鹽引起的血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，對(duì)于治療與過(guò)氧亞硝酸鹽生成相關(guān)的炎癥性疾病具有潛在的臨床意義。

6、d-青霉胺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載在《中華人民共和國(guó)藥典》（2020?年版）、《美國(guó)藥典》（2024?年版）和《歐洲藥典》（11.0?版）中，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并沒(méi)有對(duì)對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)前對(duì)于青霉胺對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的檢測(cè)，主要有電化學(xué)、熒光分子印記法、毛細(xì)管電色譜法、毛細(xì)管電泳法、圓二色譜法、電噴霧電離質(zhì)譜法、離子淌度質(zhì)譜法、納米簇聚集誘導(dǎo)發(fā)光法和高效液相色譜、膠束液相色譜法?，其中高效液相色譜法采用價(jià)格昂貴的性固定相（csp）或手性添加劑（cmpa）進(jìn)行直接檢測(cè)外，李倚天團(tuán)隊(duì)（李倚天，劉英，李楊，hplc柱前衍生化法測(cè)定青霉胺片中的l-青霉胺，華西藥學(xué)雜志，2022，37（1）：75-77）報(bào)道了用茚三酮作為衍生試劑進(jìn)行柱前衍生測(cè)定l-青霉胺，但存在分離度不足等情況，還需要用氯化銅和l-脯氨酸作為流動(dòng)相，增加色譜柱的負(fù)擔(dān)。

7、因此，提供一種柱前衍生液相色譜法測(cè)定青霉胺對(duì)映異構(gòu)體含量的方法，衍生化試劑廉價(jià)易得，衍生步驟簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)，分離效果好，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，是本技術(shù)領(lǐng)域函待解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種柱前衍生液相色譜法測(cè)定青霉胺對(duì)映異構(gòu)體含量的方法，衍生化試劑廉價(jià)易得，衍生步驟簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)，分離效果好，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，在系統(tǒng)適用性、重復(fù)性、專屬性、準(zhǔn)確度方面完全符合中國(guó)藥典方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則，可用于青霉胺異構(gòu)體的質(zhì)量控制。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、針對(duì)現(xiàn)有分析方法的一些問(wèn)題，本發(fā)明第一個(gè)方面是提供了青霉胺異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)如下：

4、，其中r1、r2選自硝基或氫基；r3選自氟或氯；r4分別獨(dú)立選自氫、甲基、乙基、異丙基、苯基、芐基中的任一種。

5、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述r1為硝基；r2為硝基；r3選自氟；r4為甲基、異丙基、芐基中的任一種。

6、本發(fā)明提供的青霉胺柱前衍生化反應(yīng)是衍生化試劑與消旋青霉胺dl-青霉胺發(fā)生烷基化反應(yīng)，增加對(duì)映異構(gòu)體空間結(jié)構(gòu)差異，從而實(shí)現(xiàn)有效的分離。所述的分離方法的反應(yīng)方程式如下（青霉胺的衍生化反應(yīng)）：

7、

8、

9、d構(gòu)型衍生物????????????????????????????????l構(gòu)型衍生物

10、本發(fā)明公開(kāi)一種柱前衍生液相色譜法測(cè)定青霉胺對(duì)映異構(gòu)體含量的方法，即d-青霉胺中l(wèi)-青霉胺的檢測(cè)方法或l-青霉胺中d-青霉胺的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

11、（1）將樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液在堿性溶液中進(jìn)行衍生反應(yīng)，再加入酸溶液終止反應(yīng)，得到衍生反應(yīng)液；

12、（2）將衍生反應(yīng)液用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件為：色譜柱為c18柱，流動(dòng)相為流動(dòng)相a和流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相a為0.1%磷酸水溶液，流動(dòng)相b為乙腈，柱溫為20-40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為?335nm。

13、步驟（1）中所述的衍生液為marfey試劑及其衍生物的有機(jī)溶液，具體的，所述的marfey試劑及其衍生物選自na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-l-丙氨酰胺(fdnp-ala-nh2)、nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-l-纈氨酰胺(fdnp-val-nh2)、nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-l-苯丙酰胺(?fdnp-l-phe-nh2)、nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-l-脯氨酰胺(?fdnp-l-pro-nh2)。

14、所述的衍生液為marfey試劑及其衍生物的有機(jī)溶液中的有機(jī)溶液選自二甲亞砜、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇中的一種或多種。

15、再優(yōu)選的所述的有機(jī)溶液為二甲亞砜。

16、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述的衍生液濃度為1-5g/l;

17、優(yōu)選的所述的衍生液濃度為1-3g/l;

18、再優(yōu)選的，所述的衍生液的濃度為2g/l。

19、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述的衍生液的制備方法為：稱取400mg?衍生試劑于200ml容量瓶，加二甲亞砜溶解并稀釋至刻度線，搖勻。

20、步驟（1）中所述的堿性溶液為堿的水溶液，所述的堿選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸氫二鉀、三乙胺、乙二胺、苯胺中的一種或多種。

21、再優(yōu)選的，所述的堿為三乙胺。

22、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述的堿性溶的濃度為0.01-0.1mol/l;

23、優(yōu)選的所述的堿溶液濃度為0.03-0.06mol/l;

24、再優(yōu)選的，所述的堿溶液濃度為0.05mol/l。

25、步驟（1）中所述的酸溶液為酸的水溶液，所述的酸選自鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、高氯酸、三氟乙酸、醋酸、甲酸中的一種或多種。

26、再優(yōu)選的，所述的酸為醋酸。

27、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述的酸溶液的濃度為0.01-0.1mol/l;

28、優(yōu)選的，所述的酸溶液濃度為0.03-0.06mol/l;

29、再優(yōu)選的，所述的酸溶液濃度為0.05mol/l。

30、具體地，所述的衍生反應(yīng)為：先將樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液在堿性溶液存在下反應(yīng)后，再加入酸性溶液。

31、優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液的濃度為0.5-3mg/ml；

32、再優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液的濃度為2mg/ml。

33、具體地，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液的體積比為1：（1-10）；

34、優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液的體積比為1：（4-6）;

35、再優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液的體積比為1：5。

36、具體地，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與堿性溶液的體積比為1：（0.1-5）；

37、優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與堿性溶液的體積比為1：（0.5-2）;

38、再優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與堿性溶液的體積比為1：1。

39、具體地，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液反應(yīng)的時(shí)間為1-90min；

40、優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液反應(yīng)的時(shí)間為50-70min;

41、再優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與衍生液反應(yīng)的時(shí)間為60min。

42、具體地，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與酸溶液的體積比為1：（0.1-5）；

43、優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與酸溶液的體積比為1：（1-3）;

44、再優(yōu)選的，所述的樣品儲(chǔ)備溶液與酸溶液的體積比為1：2。

45、具體地，步驟（2）中所述的c18柱包括agilent?z0rbax?sb-c18、agilentporoshell?120?ec-c18、welch?ultimate?xb-c18、welch?ultimate?lp-c18?、welchultimate?aq-c18、welch?ultimate?plus?c18、welch?ultimate?alk-c18、welch?ultimatexs-c18、ymctriart?c18、thermo?bds?hypersil?c18?、waters?sunfire?c18?、watersxbridge?c18中的任意一種；

46、優(yōu)選的，步驟（2）中所述的c18柱為agilent?poroshell?120?ec-c18。

47、具體地，步驟（2）中所述的c18柱的規(guī)格為4.6mm×150mm×2.7μm。

48、具體地，步驟（2）中所述的梯度洗脫程序?yàn)椋?/p>

49、0min，40-60%a，40-60%b；

50、15min，40-60%a，40-60%b；

51、25min，50-70%a，30-50%b；

52、25.5min，30-40%a，60-70%b；

53、27min，30-40%a，60-70%b；

54、27.1min，40-60%a，40-60%b；

55、33min，40-60%a，40-60%b。

56、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm-340nm，優(yōu)選為330-340nm，更為優(yōu)選為335nm。

57、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，色譜柱溫度為30-40℃，優(yōu)選為35℃。

58、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，流動(dòng)相流速為0.9-1.1ml/min，優(yōu)選為1.0ml/min。

59、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，優(yōu)選地，進(jìn)樣量為5μl。

60、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

61、本發(fā)明采用常規(guī)堿性條件下衍生，常規(guī)酸進(jìn)行終止反應(yīng)，簡(jiǎn)化了衍生步驟，提高了檢測(cè)效率；本發(fā)明提供的柱前衍生液相色譜法測(cè)定青霉胺對(duì)映異構(gòu)體含量的方法，增強(qiáng)青霉胺的響應(yīng)值，運(yùn)用普通的液相紫外聯(lián)用技術(shù)，定量限達(dá)到0.3μl/ml；本發(fā)明的方法的流動(dòng)相梯度，可有效地避免原料中其他氨基酸及對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的各類干擾；本發(fā)明以磷酸和乙腈等常規(guī)試劑作為流動(dòng)相，很好地減少了對(duì)色譜柱的損傷；本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，樣品制備速度快，衍生化試劑廉價(jià)易得，抗干擾能力強(qiáng)，分離效果好，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了青霉胺異構(gòu)體的有效分離，分離度大于2，在進(jìn)行一個(gè)異構(gòu)體雜質(zhì)檢測(cè)的同時(shí)能對(duì)另一個(gè)主藥進(jìn)行含量測(cè)定，具有很好的實(shí)用性。