背景技術(shù)：

1、治療性抗體廣泛用于治療嚴重疾病。它們中的大多數(shù)會改變免疫細胞并在免疫突觸內(nèi)發(fā)揮作用；引導體液免疫應答的重要細胞間相互作用。盡管產(chǎn)生并評估了許多抗體設計，但缺乏用于系統(tǒng)抗體表征和功能預測的高通量工具。

2、免疫突觸的形成是由t細胞與其對應的抗原呈遞細胞(apc)的相互作用誘導的適應性免疫反應的第一事件。這種快速形成的細胞-細胞界面是通過由t細胞受體(tcr)識別負載肽的mhc復合物而啟動的。它涉及細胞骨架的肌動蛋白絲的重排以及向新生突觸募集信號傳導、共刺激、共抑制和粘附分子[1,2]。該過程對于觸發(fā)和微調(diào)t細胞應答并確保完整的免疫反應是至關(guān)重要的。已經(jīng)在若干種免疫相關(guān)病癥中觀察到功能失調(diào)的免疫突觸形成[3-8]，并且因此已經(jīng)被認為是通過調(diào)節(jié)其組裝或功能來刺激或抑制免疫應答的潛在靶標[9-11]。例如，開發(fā)了各種改變免疫突觸形成以治療癌癥和自身免疫性疾病的治療性抗體[12-15]。盡管近年來已經(jīng)在開發(fā)免疫突觸靶向劑方面取得了重大進展[9]，但仍需要進一步完善化合物，特別是提高其功效。已經(jīng)鑒定到，抗體大小和形式[16,17]、劑量以及靶標表達[18]可能是免疫突觸形成及其對t細胞功能的影響的關(guān)鍵參數(shù)。

3、然而，目前尚未報道用于系統(tǒng)地定量和表征免疫突觸形態(tài)、研究其與t細胞應答的相關(guān)性或鑒定在體外預測抗體功效的特性的方法。

4、為此目的進行高通量數(shù)據(jù)采集的關(guān)鍵技術(shù)是成像流式細胞術(shù)(ifc)，從而將傳統(tǒng)流式細胞術(shù)的益處與單細胞水平上的深度多通道成像相結(jié)合。ifc最近已經(jīng)成功應用于可視化和定量原代人t:apc細胞綴合物的免疫突觸[19-21]，然而，這些研究都沒有調(diào)查在t細胞功能背景下免疫突觸的形成。

5、最近的研究已經(jīng)證明了機器學習算法在對高通量成像數(shù)據(jù)進行更穩(wěn)健且準確的分析方面的潛力，這種方法已經(jīng)被證明可克服常規(guī)門控策略的局限性[22-24]。利用機器學習進行ifc數(shù)據(jù)分析還使得能夠鑒定細胞中的形態(tài)模式、對rna和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進行組合分析并且實施預測模型[22-26]。雖然為ifc數(shù)據(jù)分析設計的有限開源軟件實施方案是可用的[26,27]，但它們要么依賴于額外的軟件，增加了分析流水線的復雜性，要么只關(guān)注預測性能而缺乏可解釋性。

6、免疫突觸先前已經(jīng)通過人工apc系統(tǒng)使用對人類細胞系和原代細胞的高含量細胞成像進行研究，所述系統(tǒng)利用板結(jié)合的icam-1和刺激性抗體[37]。盡管german等人通過對免疫突觸進行譜分析令人信服地證明了他們的流水線的能力，但是他們沒有研究是否可以使用這些譜來預測藥物有效性[37]。在其他研究中，還研究了突觸形成在car?t細胞療法方面的潛力，其中研究人員使用染色的平均強度(諸如每個細胞的f-肌動蛋白和p-cd3ζ)、腫瘤抗原的聚類和含穿孔素顆粒的極化作為突觸形成質(zhì)量的量度。這些特征在不同的car?t細胞之間有所不同，并與其體外和體內(nèi)有效性以及臨床結(jié)果相關(guān)[39,40]。

7、m.chen等人公開，肝素結(jié)合egf樣生長因子獨立于表皮生長因子受體調(diào)節(jié)cd4+t細胞和樹突狀細胞的雙向激活(am.j.resp.crit.care,2018,meetingabstracts.a5826)。

8、b.h.hosseini等人公開，免疫突觸形成確定了通過原子力顯微鏡測得的t細胞與抗原呈遞細胞之間的相互作用力(proc.natl.acad.sci?usa?106(2009)17852-17857)。

9、f.ahmed等人公開，數(shù)字在使用成像流式細胞術(shù)對免疫突觸形成的定量和動態(tài)分析中很重要(j.immunol.meth.347(2009)79-86)。

10、g.wabnitz等人公開，人白細胞的流入顯微鏡是用于對免疫突觸中的肌動蛋白重排進行定量分析的工具(j.immunol.meth.423(2015)29-39)。

11、us2021/270812公開了用于分析免疫細胞的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本文報道了一種用于使用單細胞成像流式細胞術(shù)對細胞混合物中的細胞進行分類的方法。

2、本文進一步報道了一種用于使用單細胞成像流式細胞術(shù)與人工智能的組合(scifai)對細胞混合物中的細胞進行分類以對成像流式細胞術(shù)(ifc)數(shù)據(jù)進行預處理、特征工程和可說明的預測性機器學習的方法。圖40中呈現(xiàn)了算法流程圖。

3、利用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以分析不同免疫刺激下的類別頻率以及形態(tài)變化。通過分析跨多個供體和治療性抗體的t細胞因子產(chǎn)生，已經(jīng)證明了根據(jù)本發(fā)明的方法的適用性。已經(jīng)在體外定量地預測這些特性，從而將形態(tài)特征與功能聯(lián)系起來，并顯示出顯著影響抗體設計的潛力。

4、根據(jù)本發(fā)明的方法普遍適用于ifc數(shù)據(jù)，并且考慮到其模塊化架構(gòu)，可以直接并入到現(xiàn)有的工作流程和分析流水線中，例如用于快速抗體篩選和功能表征。

5、因此，本發(fā)明涵蓋以下實施例：

6、1.一種用于對細胞混合物中的細胞進行分類的方法，其中所述混合物包含t細胞和活化的b細胞或抗原呈遞細胞，所述方法包括以下步驟：

7、a)將至少與f-肌動蛋白、mhcii和cd3結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于所述細胞混合物，以獲得經(jīng)標記的細胞混合物，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(任選地不重疊的)發(fā)射波長，

8、b)獲取所述細胞混合物的至少一個圖像，以及

9、c)將所述細胞混合物中的所述細胞分類為

10、i)分離的細胞，如果所述細胞為單一細胞，呈f-肌動蛋白陽性，并且

11、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

12、-呈mhcii陰性且cd3陽性，

13、ii)細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述細胞為兩個或三個或更多個細胞的聚集體，呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

14、1a.一種用于對細胞混合物中的細胞進行分類的方法，其中所述混合物包含t細胞和活化的b細胞或抗原呈遞細胞，所述方法包括以下步驟：

15、a)將至少與f-肌動蛋白、mhcii和cd3結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于所述細胞混合物，以獲得經(jīng)標記的細胞混合物，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(任選地不重疊的)發(fā)射波長，

16、b)獲取所述細胞混合物的至少一個圖像，以及

17、c)將所述圖像分類如下：

18、所述圖像包含

19、i)分離的細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性，并且

20、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

21、-呈mhcii陰性且cd3陽性，

22、ii)細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像中的所述細胞是兩個或三個或更多個細胞的聚集體，并且所述聚集體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

23、2.根據(jù)實施例1所述的方法，其中

24、步驟a)是：將至少與f-肌動蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于所述細胞混合物，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

25、并且步驟c)是：將所述細胞混合物中的所述細胞分類為

26、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

27、ii)無信號傳導的單一t細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

28、iii)有信號傳導的單一t細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

29、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

30、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

31、2a.根據(jù)實施例1a所述的方法，其中

32、步驟a)是：將至少與f-肌動蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于所述細胞混合物，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

33、并且步驟c)是：將所述圖像分類如下：

34、所述圖像包含

35、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

36、ii)無信號傳導的單一t細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

37、iii)有信號傳導的單一t細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

38、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，如果所述圖像中的所述細胞雙聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

39、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像中的所述細胞雙聯(lián)體或細胞多聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

40、3.根據(jù)實施例1至2a中任一項所述的方法，其中

41、步驟b)是：使用成像流式細胞儀獲取所述細胞混合物的圖像。

42、4.根據(jù)實施例1至3中任一項所述的方法，其中所獲取的圖像為各自示出單一細胞或分離的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的圖像。

43、5.一種用于對細胞混合物中的細胞進行分類的方法，其中所述混合物包含t細胞和活化的b細胞或抗原呈遞細胞，所述方法包括以下步驟：

44、a)獲取所述細胞混合物的至少一個圖像，

45、b)生成特征提取流水線以從所述至少一個圖像中得出生物學上可解釋的特征，

46、c)基于所得出的生物學上可解釋的特征預測所述細胞屬于以下類別之一

47、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，

48、ii)無信號傳導的單一t細胞，

49、iii)有信號傳導的單一t細胞，

50、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，

51、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

52、5a.一種用于對細胞混合物中的細胞進行分類的方法，其中所述混合物包含t細胞和活化的b細胞或抗原呈遞細胞，所述方法包括以下步驟：

53、a)獲取所述細胞混合物的至少一個圖像，

54、b)生成特征提取流水線以從所述至少一個圖像中得出生物學上可解釋的特征，

55、c)基于所得出的生物學上可解釋的特征預測所述圖像中的所述細胞為

56、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，

57、ii)無信號傳導的單一t細胞，

58、iii)有信號傳導的單一t細胞，

59、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，

60、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

61、6.根據(jù)實施例1至5a中任一項所述的方法，其中基于形態(tài)、標記強度、標記的共定位、紋理和突觸特征，(所述圖像中的)所述細胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體被分類為突觸。

62、7.根據(jù)實施例1至6中任一項所述的方法，其中基于以下一個或多個另外的特征，(所述圖像中的)所述細胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體被分類為突觸：

63、-cd3和mhcii標記的共定位，和/或

64、-mhcii和p-cd3ζ標記的共定位，和/或

65、-mhcii的紋理，和/或

66、-cd3標記的紋理，和/或

67、-p-cd3ζ標記的強度。

68、8.根據(jù)實施例1至7中任一項所述的方法，其中基于突觸區(qū)域中的標記信號強度與整個細胞的比率來確定每個細胞或雙聯(lián)體或多聯(lián)體或圖像的特征。

69、9.根據(jù)實施例1至4和6至8中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)標記的細胞混合物是通過固定所述細胞、能透過所述細胞并施加所述經(jīng)標記的抗體而獲得的細胞內(nèi)經(jīng)標記的細胞混合物。

70、9a.根據(jù)實施例1至9中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括以下步驟d)：

71、d)對每個類別中的細胞或細胞圖像的數(shù)量進行計數(shù)，并計算每個類別中的所述細胞在所述細胞混合物中的相對頻率。

72、10.根據(jù)實施例1至9a中任一項所述的方法，其中在步驟b)之前去除死細胞、變形細胞或裁剪細胞(超過三個細胞的聚集體)，或者其中不記錄死細胞、變形細胞或裁剪細胞(超過三個細胞的聚集體)的圖像，或者其中在步驟c)之前去除死細胞、變形細胞或裁剪細胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟c)中不分析死細胞、變形細胞或裁剪細胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟d)中不對死細胞、變形細胞或裁剪細胞的圖像以及未聚焦的圖像進行計數(shù)。

73、11.根據(jù)實施例1至10中任一項所述的方法，其中步驟b)包括以下另外的子步驟：

74、b-1)對焦點內(nèi)的活+cd3+mhcii+細胞進行門控，

75、b-2)使用面積和縱橫比特征從在步驟b-1)中獲得的群體中選擇示出單一cd3+t細胞和單一mhcii+b細胞或抗原呈遞細胞的圖像，

76、b-3)確定突觸掩模內(nèi)經(jīng)標記的cd3的信號強度(突觸掩模定義為形態(tài)cd3和mhcii掩模的組合，其中擴張率為3)并對掩模中示出cd3信號的突觸進行門控，以及

77、b-4)通過使用明場(bf)的高度和面積特征排除一層中的t細胞和b細胞或抗原呈遞細胞(的圖像)。

78、12.根據(jù)實施例5至11中任一項所述的方法，其中所述方法包括以下步驟c)：

79、c)基于xgboost分類器根據(jù)所得出的生物學上可解釋的特征構(gòu)建模型，并基于模型預測細胞或圖像屬于以下類別之一

80、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，

81、ii)無信號傳導的單一t細胞，

82、iii)有信號傳導的單一t細胞，

83、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，

84、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

85、13.根據(jù)實施例1至12中任一項所述的方法，其中所述混合物包含細胞比率為約4:3的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞。

86、14.根據(jù)實施例1至13中任一項所述的方法，其中所述t細胞為cd4陽性記憶t細胞或cd8陽性t細胞或其混合物。

87、15.根據(jù)實施例1至14中任一項所述的方法，其中所述t細胞為cd4陽性記憶t細胞。

88、16.根據(jù)實施例1至15中任一項所述的方法，其中在混合之后將所述細胞混合物離心。

89、17.根據(jù)實施例1至16中任一項所述的方法，其中步驟b)進一步包括使用源自經(jīng)染色的單一細胞的補償矩陣來補償所述圖像。

90、18.一種用于對細胞混合物中的細胞進行分類的方法，其中所述混合物包含t細胞和活化的b細胞或抗原呈遞細胞，所述方法包括以下步驟：

91、a)通過以下制備經(jīng)標記的細胞混合物：

92、a-1)將所述細胞混合物等分成至少兩個等分試樣，

93、a-2)向所述混合物的第一等分試樣施加與所述混合物的一個或兩個細胞上存在的一個或多個細胞表面靶標結(jié)合的抗體，并且向所述混合物的第二等分試樣施加抗體，所述抗體與施加于所述第一等分試樣的抗體具有相同的結(jié)構(gòu)，但不與所述混合物的一個或兩個細胞上存在的一個或多個細胞表面靶標結(jié)合，

94、a-3)溫育在步驟a-2)中獲得的等分試樣，

95、a-4)將至少與f-肌動蛋白、mhcii和cd3結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于在步驟a-3)中獲得的所述細胞混合物的經(jīng)溫育的等分試樣，以獲得經(jīng)標記的細胞混合物，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

96、b)獲取所述經(jīng)標記的細胞混合物的每個等分試樣的至少一個圖像，以及

97、c)分別對所述細胞混合物的每個等分試樣中的細胞圖像進行分類，以包含

98、i)分離的細胞，如果所述圖像包含的細胞為單一細胞，呈f-肌動蛋白陽性，并且

99、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

100、-呈mhcii陰性且cd3陽性，

101、ii)細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像包含的細胞是兩個或三個細胞的聚集體，呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

102、d)對于每個等分試樣，對每個類別中的細胞圖像的數(shù)量進行計數(shù)，并計算每個類別中的所述細胞在所述細胞混合物中的相對頻率，以及

103、e)確定所述第一等分試樣與所述第二等分試樣之間的類別頻率差異。

104、19.根據(jù)實施例18所述的方法，其中

105、步驟a-4)是：將至少與f-肌動蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于所述細胞混合物的所述經(jīng)溫育的等分試樣，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

106、并且步驟c)是：將所述細胞混合物中的所述細胞分類為

107、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

108、ii)無信號傳導的單一t細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

109、iii)有信號傳導的單一t細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

110、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

111、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

112、19a.根據(jù)實施例18所述的方法，其中

113、步驟a-4)是：將至少與f-肌動蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標記的抗體施加于所述細胞混合物的所述經(jīng)溫育的等分試樣，其中所述抗體各自用染料進行標記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

114、并且步驟c)是：將所述圖像分類如下：

115、所述圖像包含

116、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

117、ii)無信號傳導的單一t細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

118、iii)有信號傳導的單一t細胞，如果所述圖像中的所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

119、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，如果所述圖像中的所述雙聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

120、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像中的所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

121、20.根據(jù)實施例18至19a中任一項所述的方法，其中

122、步驟b)是：使用成像流式細胞儀獲取所述細胞混合物的圖像。

123、21.根據(jù)實施例18至20中任一項所述的方法，其中所獲取的圖像為各自示出單一細胞或分離的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的圖像。

124、22.根據(jù)實施例18至21中任一項所述的方法，其中基于形態(tài)、標記強度、標記的共定位、紋理和突觸特征，所述細胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體或其圖像被分類為突觸。

125、23.根據(jù)實施例18至22中任一項所述的方法，其中基于以下一個或多個另外的特征，所述圖像中的所述細胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體被分類為突觸：

126、-cd3和mhcii標記的共定位，和/或

127、-mhcii和p-cd3ζ標記的共定位，和/或

128、-mhcii的紋理，和/或

129、-cd3標記的紋理，和/或

130、-p-cd3ζ標記的強度。

131、24.根據(jù)實施例18至23中任一項所述的方法，其中基于突觸區(qū)域中的標記信號強度與整個細胞的比率來確定每個細胞或雙聯(lián)體或多聯(lián)體或圖像的特征。

132、25.根據(jù)實施例18至24中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)標記的細胞混合物是通過固定所述細胞、能透過所述細胞并施加所述經(jīng)標記的抗體而獲得的細胞內(nèi)經(jīng)標記的細胞混合物。

133、26.根據(jù)實施例18至25中任一項所述的方法，其中在步驟b)之前去除死細胞、變形細胞或裁剪細胞(超過三個細胞的聚集體)，或者其中不記錄死細胞、變形細胞或裁剪細胞(超過三個細胞的聚集體)的圖像，或者其中在步驟c)之前去除死細胞、變形細胞或裁剪細胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟c)中不分析死細胞、變形細胞或裁剪細胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟d)中不對死細胞、變形細胞或裁剪細胞的圖像以及未聚焦的圖像進行計數(shù)。

134、27.根據(jù)實施例18至26中任一項所述的方法，其中步驟b)包括以下另外的子步驟：

135、b-1)對焦點內(nèi)的活+cd3+mhcii+細胞進行門控，

136、b-2)使用面積和縱橫比特征從在步驟b-1)中獲得的群體中選擇示出單一cd3+t細胞和單一mhcii+b細胞或抗原呈遞細胞的圖像，

137、b-3)確定突觸掩模內(nèi)經(jīng)標記的cd3的信號強度(突觸掩模定義為形態(tài)cd3和mhcii掩模的組合，其中擴張率為3)并對掩模中示出cd3信號的突觸進行門控，以及

138、b-4)通過使用明場(bf)的高度和面積特征排除一層中的t細胞和b細胞或抗原呈遞細胞。

139、28.根據(jù)實施例18至27中任一項所述的方法，其中所述混合物包含細胞比率為約4:3的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞。

140、29.根據(jù)實施例18至28中任一項所述的方法，其中所述t細胞為cd4陽性記憶t細胞或cd8陽性t細胞或其混合物。

141、30.根據(jù)實施例18至29中任一項所述的方法，其中所述t細胞為cd4陽性記憶t細胞。

142、31.根據(jù)實施例18至30中任一項所述的方法，其中在混合之后將所述細胞混合物離心。

143、32.根據(jù)實施例18至31中任一項所述的方法，其中步驟b)進一步包括使用源自經(jīng)染色的單一細胞的補償矩陣來補償所述圖像。

144、33.一種對大量抗體中的抗體進行排序的方法，所述方法包括以下步驟：

145、1)單獨對所述大量抗體中的每種抗體執(zhí)行根據(jù)實施例18至31中任一項所述的方法，或者對所有抗體一起執(zhí)行所述方法，其中每種抗體被施加于所述混合物的單獨等分試樣，

146、2)基于以下類別中的一個或多個類別(的圖像)的頻率變化對所述抗體進行排序：

147、i)單一b細胞或抗原呈遞細胞，

148、ii)無信號傳導的單一t細胞，

149、iii)有信號傳導的單一t細胞，

150、iv)形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，以及

151、v)形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

152、34.根據(jù)實施例33所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是按免疫應答刺激降低而定的。

153、35.根據(jù)實施例33至34中任一項所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是通過降低被分類為形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的細胞或圖像的頻率來進行的。

154、36.根據(jù)實施例33至35中任一項所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是通過進一步降低突觸區(qū)域中的經(jīng)標記的f-肌動蛋白、經(jīng)標記的p-cd3ζ和經(jīng)標記的mhcii的信號強度來進行的。

155、37.根據(jù)實施例33所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是按免疫應答抑制降低而定的。

156、38.根據(jù)實施例33和37中任一項所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是通過降低被分類為形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的細胞或圖像的頻率進行的。

157、39.根據(jù)實施例33和37至38中任一項所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是通過進一步增加被分類為無信號傳導的單一t細胞的細胞或圖像的頻率來進行的。

158、40.根據(jù)實施例33和37至39中任一項所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是通過進一步降低被分類為有信號傳導的單一t細胞的細胞或圖像的頻率來進行的。

159、41.根據(jù)實施例33和37至40中任一項所述的方法，其中對所述大量抗體中的所述抗體進行排序是通過進一步增加經(jīng)標記的f-肌動蛋白的平均信號強度的頻率、通過增加突觸區(qū)域內(nèi)的經(jīng)標記的p-cd3ζ的強度的信號并通過使t細胞受體的信號解聚類來進行的。

160、42.根據(jù)實施例1至41中任一項所述的方法用于表征在t細胞與b細胞或抗原呈遞細胞之間形成的突觸的形態(tài)的用途。

161、43.根據(jù)實施例33至41中任一項所述的方法用于確定抗體濃度與t細胞應答之間的相關(guān)性的用途。

162、44.根據(jù)實施例33至41中任一項所述的方法用于預測抗體的治療模式的用途。

163、45.根據(jù)實施例33至41中任一項所述的方法用于預測抗體的功效的用途。

164、46.f-肌動蛋白、mhcii和cd3用于對包含t細胞和b細胞或活化的b細胞或抗原呈遞細胞的混合物中的t細胞進行分類的用途。

165、47.f-肌動蛋白、mhcii和cd3用于對包含t細胞和b細胞或活化的b細胞或抗原呈遞細胞的混合物中的b細胞進行分類的用途。

166、48.根據(jù)實施例46至47中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為分離的細胞，即，所述細胞的分類在于所述細胞為分離的細胞，如果所述細胞為單一細胞，呈f-肌動蛋白陽性，并且

167、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

168、-呈mhcii陰性且cd3陽性。

169、49.根據(jù)實施例46至47中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，即，所述細胞的分類為所述細胞為細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述細胞為兩個或三個細胞的聚集體，呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

170、50.根據(jù)實施例46至49中任一項所述的用途，其進一步包括p-cd3ζ。

171、51.根據(jù)實施例46至50中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為單一b細胞或抗原呈遞細胞，即，所述細胞的分類為所述細胞為單一b細胞或抗原呈遞細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性。

172、52.根據(jù)實施例46至51中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為無信號傳導的單一t細胞，即，所述細胞的分類為所述細胞為無信號傳導的單一t細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性。

173、53.根據(jù)實施例46至52中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為有信號傳導的單一t細胞，即，所述細胞的分類為所述細胞為有信號傳導的單一t細胞，如果所述細胞呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

174、54.根據(jù)實施例46至53中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞與t細胞的雙聯(lián)體，即，所述細胞的分類為所述細胞為形成無信號傳導的突觸的b細胞或抗原呈遞細胞和t細胞的雙聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性。

175、55.根據(jù)實施例46至54中任一項所述的用途，其中所述圖像包含或所述細胞被分類為形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，即，所述細胞的分類為所述細胞為形成有信號傳導的突觸的一個或兩個或多個b細胞或抗原呈遞細胞和一個或兩個或多個t細胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

176、56.根據(jù)實施例1至55中任一項所述的方法或用途，其中所述多聯(lián)體為兩種b細胞或抗原呈遞細胞和一種t細胞的多聯(lián)體。

177、57.根據(jù)實施例1至55中任一項所述的方法或用途，其中所述多聯(lián)體為一種b細胞或抗原呈遞細胞和兩種t細胞的多聯(lián)體。

178、除了所描繪和要求保護的各種實施例之外，所公開的主題還涉及具有本文所公開和要求保護的特征的其他組合的其他實施例。這樣，本文所呈現(xiàn)的具體特征可以在所公開的主題的范圍內(nèi)以其他方式彼此組合，使得所公開的主題包括本文所公開的特征的任何合適的組合。出于圖示和描述的目的，已經(jīng)呈現(xiàn)了所公開主題的具體實施例的前文描述。其并不旨在窮舉或?qū)⑺_的主題限制為所公開的那些實施例。