本發(fā)明涉及分子生物學(xué)育種，具體涉及適用于植物葉片的核酸提取液、快速提取方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、分子育種(molecular?breeding)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性技術(shù)，通過(guò)結(jié)合分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)手段，精準(zhǔn)操控和優(yōu)化動(dòng)植物遺傳信息，實(shí)現(xiàn)高效、定向的遺傳改良。相較于傳統(tǒng)育種依賴表型觀察和自然雜交的方式，分子育種能夠顯著縮短育種周期、提高目標(biāo)性狀的精準(zhǔn)度，并突破物種間的遺傳限制，為解決糧食安全、資源短缺和氣候變化等全球性問題提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。分子育種的核心技術(shù)手段就包括分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted?selection,mas)，這一技術(shù)可以通過(guò)dna標(biāo)記與目標(biāo)性狀的連鎖關(guān)系在早期篩選出優(yōu)良基因個(gè)體。dna標(biāo)記的鑒定是篩選個(gè)體的關(guān)鍵。

2、高通量基因分型及熒光pcr應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)：基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chainreaction，pcr)的dna標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)是目前的主流技術(shù)，這是一種用于指數(shù)擴(kuò)增特定的核酸片段并用熒光信號(hào)來(lái)判斷dna標(biāo)記是否存在的分子鑒定方法，其最大特點(diǎn)是能將微量的核酸進(jìn)行克隆后獲得大量相同片段，并根據(jù)片段結(jié)合的熒光信號(hào)進(jìn)行定量檢測(cè)。pcr過(guò)程為酶促反應(yīng)，酶的催化需要較為純凈，符合要求的核酸樣本。

3、現(xiàn)有核酸提取法的挑戰(zhàn)：目前的分子檢測(cè)中，較為常用的提取方法為磁珠法和柱膜法，這兩種方法可以獲得較為純凈的核酸樣本。雖然磁珠法可以適配自動(dòng)化平臺(tái)，但這兩種方法仍要經(jīng)歷較多步驟進(jìn)行純化，相關(guān)的自動(dòng)化設(shè)備和耗材成本較高。同時(shí)，提取過(guò)程中也可能需要使用到有毒試劑，危害操作人員的健康。

4、因此，開發(fā)一種無(wú)毒無(wú)害、操作簡(jiǎn)便、成本低廉且易于操作的核酸提取方法仍是目前分子育種中亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供適用于植物葉片的核酸提取液，該提取液不僅可獲得足量dna進(jìn)行后續(xù)pcr實(shí)驗(yàn)，且在已有提取方法提取效果不降低的情況下，提取液的組分更簡(jiǎn)單。

2、此外，本發(fā)明還提供基于上述核酸提取液的快速提取方法及其應(yīng)用，以減少核酸提取過(guò)程中有毒試劑的使用、簡(jiǎn)化核酸提取步驟、極大縮短核酸提取純化時(shí)間，從而顯著提高檢測(cè)通量。

3、本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、適用于植物葉片的核酸提取液，由60mm的tris-hcl、20mm的edta和質(zhì)量/體積比為0.5％的sds配制而成。

5、本發(fā)明基于現(xiàn)有核酸提取存在的問題，本著減少核酸提取過(guò)程中有毒試劑的使用、簡(jiǎn)化核酸提取步驟、縮短核酸提取純化時(shí)間的目的，設(shè)計(jì)了上述核酸提取液。

6、本發(fā)明上述核酸提取液不僅配方簡(jiǎn)單，且用于植物葉片提取核酸獲得的dna較為穩(wěn)定，使用簡(jiǎn)單提取液即可獲得足量dna進(jìn)行后續(xù)pcr實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于現(xiàn)在已有提取方法提取效果不降低的情況下，提取液的組分更簡(jiǎn)單。

7、雖然本發(fā)明核酸提取液中的三個(gè)組份均是常見的核酸提取用試劑，但是，在本技術(shù)之前，tris-hcl、edta和sds均是需要與其他試劑組合才可用于核酸提取，例如：cn117778378a公開了的一種核酸提取液試劑盒及其應(yīng)用中，將月桂基麥芽糖新戊二醇、tween-20、以及胍鹽、緩沖液、鈉鹽、乙二胺四乙酸、異丙醇中的至少一種進(jìn)行組合，用于病毒的dna提?。籧n118256486a公開的核酸提取液核酸提取試劑盒及其應(yīng)用中，將(5-環(huán)己基戊基)-β-d-麥芽糖苷、tritonx-100和胍鹽、緩沖液、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇中的一種以上進(jìn)行組合用于病毒的dna提??；cn?cn115521932b公開的一種核酸提取裂解_結(jié)合液核酸提取溶液體系及試劑盒中，將異硫氰酸胍、sds、n-甲基乙酰胺、四甘醇；triton?x-100、tris-hcl、edta·2na、硅羥基磁珠進(jìn)行組合用于血漿樣本的dna提取。

8、但是，并未有現(xiàn)有技術(shù)給出將tris-hcl、edta和sds三者以特定濃度進(jìn)行組合，可用于植物葉片進(jìn)行核酸提取，實(shí)現(xiàn)了在已有提取方法提取效果不降低的情況下，提取液的組分更簡(jiǎn)單的效果。

9、本發(fā)明的酸提取液中特定濃度的tris-hcl、edta和sds的作用如下：

10、tris-hcl(60mm)：構(gòu)建dna穩(wěn)定的ph環(huán)境。

11、(1)ph緩沖機(jī)制：tris-hcl在60mm濃度下可將體系ph維持在7.5-8.0(dna最佳穩(wěn)定區(qū)間)。dna鏈在酸性條件下易發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)，堿性條件下易解鏈，穩(wěn)定的ph可避免核酸骨架因酸堿波動(dòng)而斷裂。

12、(2)濃度合理性：60mm屬于中等強(qiáng)度緩沖體系，既能抵抗提取過(guò)程中細(xì)胞裂解釋放的酸性物質(zhì)(如代謝產(chǎn)物)，又不會(huì)因緩沖能力過(guò)強(qiáng)而影響后續(xù)酶反應(yīng)(如pcr)。

13、edta(20mm)：高效抑制核酸酶活性。

14、金屬離子螯合作用：edta通過(guò)高濃度(20mm)螯合mg2+、ca2+等核酸酶(如dnase)的必需輔因子，使酶活性中心失活。相比常規(guī)1-5mm濃度，20mm?edta對(duì)頑固核酸酶(如血清、組織中的dnase)的抑制效果更強(qiáng)，可有效阻斷dna降解路徑。

15、額外穩(wěn)定作用：edta還能與dna雙鏈表面的金屬離子結(jié)合，減少離子介導(dǎo)的dna構(gòu)象變化，間接增強(qiáng)雙鏈穩(wěn)定性。

16、sds(0.5％)：雙重保護(hù)dna免受酶解。

17、核酸酶變性作用：0.5％?sds作為強(qiáng)去污劑，可破壞核酸酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(如二硫鍵、疏水基團(tuán))，使其徹底失活。該濃度既能高效變性細(xì)胞內(nèi)核酸酶，又避免因濃度過(guò)高(如1％)導(dǎo)致sds難以去除，進(jìn)而干擾dna后續(xù)操作(如酶切、測(cè)序)。

18、裂解與保護(hù)協(xié)同：sds通過(guò)破壞細(xì)胞膜釋放dna的同時(shí)，其帶負(fù)電荷的硫酸根基團(tuán)可與dna結(jié)合，形成“保護(hù)層”，減少dna與核酸酶的接觸概率。

19、基于上述核酸提取液的植物葉片核酸的快速提取方法，包括如下步驟：

20、將植物葉片打碎后獲得碎末，在碎末中加入核酸提取液，震蕩混勻并高溫水浴，即可獲得提取的核酸。

21、基于本發(fā)明的酸提取液進(jìn)行植物葉片核酸提取的方法具有如下優(yōu)勢(shì)：

22、1)：快速釋放植物葉片中的核酸，用于基因分型等下游實(shí)驗(yàn)；

23、2)：本核酸提取液中不含有毒試劑，可以保證實(shí)驗(yàn)操作人員的安全；

24、3)：本提取方法不經(jīng)過(guò)任何純化步驟，大幅縮短了操作時(shí)間，具有操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)勢(shì)。

25、綜上，本發(fā)明的快速提取方法工作流程簡(jiǎn)便：使用96孔板，單板提取時(shí)間僅需15分鐘作用，提取后的核酸無(wú)需進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。

26、進(jìn)一步地，植物葉片的樣本類型包括新鮮的、干燥的植物成苗葉片和組織培養(yǎng)獲得的葉片。

27、進(jìn)一步地，獲取碎末的過(guò)程如下：

28、使用打孔器取樣0.4-1.6mg，將取得的樣本置于96孔深孔板中或田間采樣管中，使用直徑為5mm鋼珠打碎。

29、進(jìn)一步地，高溫水浴的溫度為90℃，時(shí)間為10min。

30、進(jìn)一步地，高溫水浴過(guò)程中，每5min震蕩混勻30s。

31、進(jìn)一步地，提取獲得的核酸能夠在4℃條件下儲(chǔ)存48h。

32、上述核酸提取液在植物葉片核酸提取中的應(yīng)用，植物葉片的植物類型包括玉米、番茄、黑莓和洋薊。

33、上述核酸提取液在基因分型pcr檢測(cè)中的應(yīng)用，先利用核酸提取液提取植物葉片的核酸，然后加入超純水，充分震蕩混勻、離心取上清液加入純水用于基因分型檢測(cè)。

34、進(jìn)一步地，離心的轉(zhuǎn)速為3500-3600rmp，時(shí)間為4-5min。

35、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

36、1、本發(fā)明的核酸提取液將特定濃度的tris-hcl、edta和sds直接組合可用于植物葉片核酸提取，具有配方簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，使用簡(jiǎn)單提取液即可獲得足量dna進(jìn)行后續(xù)pcr實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于現(xiàn)在已有提取方法提取效果不降低的情況下，提取液的組分更簡(jiǎn)單。

37、2、利用本發(fā)明的核酸提取液進(jìn)行植物葉片核酸提取，具有工作流程簡(jiǎn)便、時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，使用96孔板，單板提取時(shí)間僅需15分鐘作用，提取后的核酸無(wú)需進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。

38、3、利用本發(fā)明的核酸提取液進(jìn)行植物基因分型pcr檢測(cè)，具有檢測(cè)準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)：位點(diǎn)檢出率≥98％，基因型分型檢測(cè)準(zhǔn)確率≥99.5％。

39、4、利用本發(fā)明的核酸提取液進(jìn)行植物葉片核酸提取，不同種類樣本適配性高：兼容多種植物葉片樣本處理，適配低起始樣本投入量，性能表現(xiàn)穩(wěn)定。