本發(fā)明涉及免疫學(xué)和分子生物學(xué)，具體涉及一種靶向密蛋白18.2的納米抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、緊密連接(tight?junctions，tjs)是一種重要的細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)，主要存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中，使相鄰細(xì)胞膜緊靠在一起，形成環(huán)繞細(xì)胞的物理屏障結(jié)構(gòu)。緊密連接膜結(jié)構(gòu)域包含至少三種不同的蛋白質(zhì)，分別稱為occludins(咬合蛋白)，claudins(閉合蛋白)和junctio?nal?adhesion?molecules(jams，連接黏附分子)。其中claudins(cldns)是1998年首次發(fā)現(xiàn)的一類跨膜蛋白，至少有27個(gè)家族成員。cldns具有四次跨膜結(jié)構(gòu)域，n末端和c末端均位于細(xì)胞質(zhì)中。cldn18是cldns蛋白家族中被廣泛研究的密蛋白，于2001年被首次鑒定。人類cldn18基因有兩個(gè)剪接變體，分別編碼cldn18.1和cldn18.2(密蛋白18.2)兩種蛋白亞型，二者均由261個(gè)氨基酸組成，具有兩個(gè)胞外環(huán)，僅在胞外環(huán)1中存在8個(gè)氨基酸差別。在人體中，cldn?18.1和cldn18.2的表達(dá)具有組織特異性，cldn18.1主要表達(dá)在肺組織中，cldn18.2在正常的組織中僅表達(dá)在分化的胃粘膜上表皮細(xì)胞上，不表達(dá)在胃干細(xì)胞上。而在多種腫瘤組織中，cldn?18.2卻高度表達(dá)，比如非小細(xì)胞肺癌(25％)、胃癌(70～80％)、胰腺癌(60％)和食道癌(30％)。雖然cldn18.2在正常胃粘膜中也表達(dá)，但胃粘膜中表達(dá)的cldn18.2存在于細(xì)胞緊密連接超分子復(fù)合物中，抗原表位難以接觸靶向藥物，而惡性腫瘤細(xì)胞由于極性的喪失導(dǎo)致了cldn18.2表位的暴露，與靶向藥物得以接觸。這種特性使cldn18.2成為消化道腫瘤靶向治療的理想靶點(diǎn)。

2、截止目前，全球在cldn18.2靶點(diǎn)的研發(fā)管線覆蓋所有主流技術(shù)路線，包擴(kuò)單克隆抗體、抗體偶聯(lián)藥物(adc)、雙特異性抗體和嵌合抗原受體t細(xì)胞(car-t)，其中單抗及adc路線布局最多。進(jìn)展最快的靶向藥物是日本藥企安斯泰來(lái)開發(fā)的cldn18.2單抗藥物imab362(zolbetuxi?mab，佐妥昔單抗)，已于今年先后被日本厚生勞動(dòng)省(mhlw)和美國(guó)fda批準(zhǔn)用于cldn18.2陽(yáng)性胃癌患者的治療，成為全球首款cldn18.2靶向藥物。cldn18.2?car-t方向進(jìn)展最快的為科濟(jì)藥業(yè)研發(fā)的一種用于治療胃癌、胰腺癌及其它實(shí)體瘤的自體car-t細(xì)胞候選產(chǎn)品ct041，目前相關(guān)臨床試驗(yàn)已進(jìn)入ii期。這些研究顯示了cldn18.2靶點(diǎn)的安全性和靶向治療的有效性。

3、重鏈抗體是在駱駝科動(dòng)物、護(hù)士鯊、大星鯊和鰩魚等軟骨魚綱動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的天然缺失輕鏈的單重鏈結(jié)構(gòu)域抗體。克隆重鏈抗體可變區(qū)，可得到只有重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(singledomain?antibody，sdab)，因其分子量小，也被稱為納米抗體(nanobodies,nbs)。雖然納米抗體的分子量?jī)H為完整傳統(tǒng)抗體的1/10(約15kda)，但卻保留了重鏈抗體的完整的抗原識(shí)別和結(jié)合能力，而且與傳統(tǒng)抗體相比，具有特異性強(qiáng)，親和力強(qiáng)，穩(wěn)定性高，靶向性和組織穿透力強(qiáng)，免疫原性低，易于人源化改造等優(yōu)點(diǎn)。納米抗體的缺點(diǎn)在于半衰期短，但可將其與抗血清白蛋白或抗體的fc段融合表達(dá)以延長(zhǎng)其在血液中的半衰期。納米抗體已被廣泛用于生化機(jī)制和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究，以及用于腫瘤等疾病的診斷試劑和治療藥物的開發(fā)。

4、消化道腫瘤在世界上屬于高發(fā)病率的實(shí)體瘤，我國(guó)更是胃癌、胰腺癌等消化道癌癥的高發(fā)國(guó)家，雖然目前已有靶向cldn18.2靶點(diǎn)的臨床在研抗體和car-t藥物，但上市藥物僅有一款，仍有繼續(xù)開發(fā)靶向cldn18.2靶點(diǎn)抗體的迫切需要。本發(fā)明旨在開發(fā)新的靶向cldn18.2的抗體，特別是只特異性識(shí)別cldn18.2而不識(shí)別cldn18.1的候選納米抗體分子，用于開發(fā)消化系統(tǒng)腫瘤等疾病的診斷試劑、靶向性抗體藥物和car-t/nk等免疫細(xì)胞藥物。鑒于此，本發(fā)明公開了一種特異性靶向密蛋白18.2的納米抗體及其應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性靶向密蛋白18.2而不識(shí)別cldn18.1的納米抗體及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，一種靶向密蛋白18.2的納米抗體，所述一種靶向密蛋白18.2的納米抗體的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列包括如seq?id?no:3所示的cdr1、如seq?id?no:8所示的cdr2、氨基酸序列如seq?id?no:14所示的cdr3。

4、進(jìn)一步，所述靶向密蛋白18.2的納米抗體的氨基酸序列如seq?id?no:20所示。

5、第二方面，一種核酸，包括編碼所述的一種靶向密蛋白18.2的納米抗體的核酸序列。

6、進(jìn)一步，編碼所述的一種靶向密蛋白18.2的納米抗體的核苷酸序列如seq?id?no:32所示。

7、第三方面，一種融合蛋白，所述融合蛋白為將所述的一種靶向密蛋白18.2的納米抗體與免疫球蛋白(igg、iga等)的fc片段融合而產(chǎn)生的重組蛋白。

8、進(jìn)一步，所述免疫球蛋白的fc片段的氨基酸序列如seq?id?no:40所示。

9、進(jìn)一步，所述免疫球蛋白的fc片段的編碼核苷酸序列如seq?id?no:41所示。

10、第四方面，一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括所述的一種靶向密蛋白18.2的納米抗體，或者所述的一種核酸，或者所述的一種融合蛋白。

11、進(jìn)一步，所述的藥物組合物的劑型包括微球制劑、微囊制劑、納米囊制劑中的至少一種。還包括藥學(xué)上可接受的輔料和/或載體。

12、第五方面，一種所述的一種靶向密蛋白18.2的納米抗體，或者所述的一種核酸，或者所述的一種融合蛋白，或者所述的一種藥物組合物在制備靶向密蛋白18.2的檢測(cè)試劑、活體成像探針或治療產(chǎn)品中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明的核心創(chuàng)新點(diǎn)在于，提供了特異性靶向密蛋白18.2(cldn18.2)而不識(shí)別cldn18.1的納米抗體分子，現(xiàn)有技術(shù)中未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的抗體cdr區(qū)序列一致的抗體，解決了現(xiàn)有技術(shù)中缺少特異性靶向cldn18.2的候選納米抗體分子的問(wèn)題。

14、本發(fā)明的有益效果是：

15、(1)本發(fā)明選用的cldn18.2靶點(diǎn)是潛在的最安全且有效的消化系統(tǒng)腫瘤治療靶點(diǎn)：cldn18.2在正常組織中僅表達(dá)在胃粘膜上皮組織細(xì)胞間緊密連接處，接觸不到周圍的靶向藥物，而在胃癌、胰腺癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌高度表達(dá)，并暴露于靶向藥物；已有研究表明靶向cldn18.2的car-t或者抗體藥物對(duì)正常表達(dá)組織無(wú)損傷，而對(duì)cldn18.2表達(dá)腫瘤組織具有特異性殺傷效果。

16、(2)本發(fā)明為消化系統(tǒng)腫瘤的靶向治療提供了候選納米抗體分子：相比血液瘤，實(shí)體瘤的特異性免疫靶向治療藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢，制約因素之一為缺少有效且安全的靶點(diǎn)；目前的研究已表明cldn18.2為消化系統(tǒng)腫瘤的安全且有效的治療靶點(diǎn)，但針對(duì)cldn18.2靶點(diǎn)的靶向藥物研究起步較晚，全球僅有一款單抗藥物剛剛在少數(shù)兩個(gè)國(guó)家上市，制約瓶頸在抗體發(fā)現(xiàn)階段，開發(fā)特異性靶向cldn18.2而不識(shí)別cldn18.1的抗體分子有一定難度，而涉及的納米抗體更是稀少。

17、(3)本發(fā)明的納米抗體具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域：(a)本發(fā)明通過(guò)羊駝免疫庫(kù)篩選得到的針對(duì)cldn18.2的6條候選納米抗體，將其c末端與人igg1的fc片段融合，在抗原蛋白cldn18.2-vlp水平上檢測(cè)其與cldn18.2抗原的結(jié)合活性(elisa檢測(cè))和親和力(spr檢測(cè))，結(jié)果都比傳統(tǒng)對(duì)照抗體imab362更好或相當(dāng)。在多種過(guò)表達(dá)cldn18.2的細(xì)胞水平上，facs檢測(cè)fc融合抗體與cldn18.2抗原的結(jié)合活性，有4條納米抗體都比傳統(tǒng)對(duì)照抗體imab362更好。(b)納米抗體相對(duì)于其它抗體具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，如其半衰期長(zhǎng)短可通過(guò)化學(xué)修飾或者蛋白融合改造進(jìn)行調(diào)節(jié)，滲透性強(qiáng)，可識(shí)別普通抗體不可及的隱蔽表位，耐胃蛋白酶，耐酸，耐熱，易生產(chǎn)，而且因?yàn)槭菃捂?，分子量小，易于和其它類型抗體組裝為雙價(jià)抗體/嵌合抗原受體(car)和多價(jià)抗體/car。因此，本發(fā)明的納米抗體，可開發(fā)成免疫檢測(cè)試劑、car-t/nk免疫細(xì)胞藥物和抗體藥物。結(jié)合cldn18.2靶點(diǎn)的特性，本發(fā)明的候選抗體，若用于癌癥的免疫診斷試劑，將具有更好的效果；若開發(fā)成細(xì)胞或抗體免疫治療藥物，則具有更低的毒副作用和更佳的臨床藥效，從而為患者提供更多的藥物選擇。

18、(4)可用于開發(fā)雙靶點(diǎn)藥物：研究發(fā)現(xiàn)密蛋白18.2(claudin18.2)與cdh17一樣為安全且有效的消化系統(tǒng)腫瘤治療靶點(diǎn)，二者在食管癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤中共表達(dá)，且臨床或臨床前試驗(yàn)證明靶向這兩個(gè)靶點(diǎn)皆可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織無(wú)傷害，故本發(fā)明的抗cldn18.2候選納米抗體可與cdh17抗體聯(lián)用開發(fā)抗cldn18.2/cdh17雙抗藥物和雙靶點(diǎn)car-t/nk藥物，有望增強(qiáng)單抗或單靶點(diǎn)car-t/nk等免疫細(xì)胞藥物的療效。