本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測，具體涉及一種犬瘟熱病毒的單克隆抗體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、犬瘟熱病毒(cdv)作為高致死性動物傳染病病原體，其早期快速檢測是阻斷疫情傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前主要檢測手段存在顯著局限性：病毒分離法耗時長且生物安全要求高；rt-pcr依賴專業(yè)設(shè)備與操作人員；膠體金免疫層析試紙條雖適合現(xiàn)場使用，但檢測限不足(檢測限≥500tcid50/ml)。這些問題在基層防控場景中嚴(yán)重制約了檢測效能。
2、現(xiàn)有抗體技術(shù)面臨多重技術(shù)瓶頸，傳統(tǒng)抗cdv單克隆抗體主要靶向h蛋白非保守表位，易因病毒變異導(dǎo)致檢測失效。其性能缺陷具體表現(xiàn)為三方面：一是抗體親和力普遍偏低(kd值多在10-8m級別)，難以有效捕獲低病毒載量樣本；二是交叉反應(yīng)風(fēng)險突出，典型如針對犬腺病毒(cav)的非特異性結(jié)合(od450值達0.8)；三是熱穩(wěn)定性不足，37℃保存30天后抗體活性衰減超30％(zhang?et?al.,characterization?of?monoclonal?antibodies?againstcanine?distemper?virus?hemagglutinin?protein,veterinary?immunology?andimmunopathology(2019),doi:10.1016/j.vetimm.2019.109865.提供了一種抗體，其抗體親和力kd＝3.2×10-8m，37℃保存30天后效價保留率68.3％)，嚴(yán)重影響試劑儲存穩(wěn)定性。
3、市售檢測產(chǎn)品在應(yīng)用層面同樣存在明顯短板。膠體金試紙條(cn109988083a)檢測限僅82.9％陽性符合率，且常溫保存期不超過6個月；elisa試劑盒(li?et?al.,anovelelisabased?on?recombinant?h?protein?for?detection?of?antibodies?againstcanine?distemper?virus,plos?one(2018),doi:10.1371/journal.pone.0198432.)雖檢測限提升至94.3％，但需復(fù)雜操作流程和專業(yè)儀器，無法滿足疫區(qū)現(xiàn)場快速篩查需求。這些技術(shù)缺陷共同凸顯了開發(fā)高靈敏、高特異性、強穩(wěn)定性的新型檢測體系的迫切性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供基于高親和力抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的熒光免疫層析檢測試劑盒及其制備方法。
2、第一方面，本發(fā)明提供一種犬瘟熱病毒的單克隆抗體，所述抗體的重鏈可變區(qū)具有seq?id?no:1所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有seq?id?no:2所示的氨基酸序列。完整重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示。所述抗體的重鏈可變區(qū)中cdr1、cdr2、cdr3分別定位于seq?id?no:1的31-35、50-66和101-103位氨基酸區(qū)段；輕鏈可變區(qū)中cdr1、cdr2、cdr3對應(yīng)seq?id?no:2的24-34、50-56和89-97位氨基酸區(qū)段。該抗體對cdv血凝素蛋白受體結(jié)合域具有高特異性，親和力常數(shù)2.7×10-11m。所述抗體的線性表位為cdv?h蛋白的第373-381位。
3、第二方面，本發(fā)明提供了所述的單克隆抗體在制備犬瘟熱病毒診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4、所述應(yīng)用包括以下步驟：
5、(1)將待測樣本與樣本處理液混合，裂解后滴加至檢測卡樣本孔，所述樣本處理液為ph?7.0-7.8的含0.1％-1％triton?x-100和0.05％-0.2％bsa的tris-hcl緩沖液；
6、(2)反應(yīng)10-15分鐘后，通過熒光免疫分析儀讀取t線與c線信號強度，或直接觀察熒光顯色結(jié)果；
7、(3)當(dāng)t/c信號比值≥1.0或t線顯色時，判定為cdv陽性。
8、進一步地，所述待測樣本為犬血清、眼鼻拭子或糞便懸液，檢測限≥97％，特異性≥99％。
9、本發(fā)明確立了所述抗體在犬瘟熱病毒診斷中的具體應(yīng)用方法：通過樣本處理液裂解血清、眼鼻拭子或糞便懸液后，能夠快速內(nèi)完成熒光檢測，當(dāng)t/c信號比值≥1.0或t線顯色時判定為陽性。該方法臨床驗證顯示特異性≥99％。
10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下有益效果：
11、1、檢測檢測限與特異性實現(xiàn)雙重突破，通過抗體cdr3區(qū)關(guān)鍵位點定向突變(yrp)使抗體親和力提升至10-11m級別，結(jié)合稀土熒光標(biāo)記技術(shù)，檢測限低至1tcid50/ml，較傳統(tǒng)膠體金法檢測限提高500倍?？贵w對cdv基因型asia-1及europe-1具有廣譜識別能力，與犬腺病毒(cav)、犬細(xì)小病毒(cpv)等病原體的交叉反應(yīng)性極低(od450＜0.1)，顯著提升檢測準(zhǔn)確性。
12、2、臨床適用性達到行業(yè)領(lǐng)先水平，在規(guī)模化臨床驗證中，試劑盒檢測靈敏度達97.1％、特異性達100％，檢出率提升至95.2％，較同類產(chǎn)品c(89.2％)具有顯著優(yōu)勢，可滿足動物疫病現(xiàn)場篩查與實驗室精準(zhǔn)診斷的雙重需求。
13、3、產(chǎn)品穩(wěn)定性取得重大突破，核心抗體在37℃加速保存30天后效價保留率＞98％，突破了同類產(chǎn)品需冷鏈運輸?shù)南拗疲档蛢\成本達60％以上。
14、4、操作流程實現(xiàn)高效便捷化，檢測過程僅需15分鐘即可完成，支持裸眼判讀定性結(jié)果與熒光分析儀定量檢測的雙模式輸出，特別適配基層獸醫(yī)站及寵物醫(yī)院等場景的即時檢測需求，大幅提升疫病防控響應(yīng)效率。
1.一種犬瘟熱病毒的單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。
2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于：所述抗體的重鏈可變區(qū)中的cdr1位于seq?id?no:1的31-35位，cdr2位于seq?id?no:1的50-66位，cdr3位于seq?id?no:1的101-103位；
3.?一種抗犬瘟熱病毒(cdv)的單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體的重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:3所示，輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
4.?根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的單克隆抗體，其特征在于：所述抗體對cdv血凝素蛋白的親和力常數(shù)2.7×10-11?m，所述抗體的線性表位為cdv?h蛋白的第373-381位。
5.權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備犬瘟熱病毒診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述待測樣本為犬血清、眼鼻拭子或糞便懸液，檢測限≥97%，特異性≥99%。