發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域和臨床輔助生殖領(lǐng)域，更具體地涉及一種無(wú)創(chuàng)方式判斷子宮內(nèi)膜容受性的方法，和該方法中所用的標(biāo)志物、預(yù)測(cè)模型和相應(yīng)的試劑盒、系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、人類(lèi)生殖過(guò)程中，受精卵在母體子宮內(nèi)定位、黏附、著床，最終發(fā)育成一個(gè)成熟的胎兒，著床過(guò)程對(duì)成功妊娠具有重要影響，成功的臨床妊娠除需要優(yōu)質(zhì)的胚胎之外還需要良好的子宮內(nèi)膜容受性(endometrial?receptivity，er)、子宮內(nèi)膜與胚胎的同步發(fā)育。子宮內(nèi)膜容受性是一種生理現(xiàn)象，是指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，只有在短暫的特定時(shí)期內(nèi)子宮內(nèi)膜才允許胚胎著床，這一時(shí)期稱(chēng)為“著床窗口期”，就成年女性而言，相當(dāng)于月經(jīng)周期第20-24日或排卵后6-8日。

2、子宮內(nèi)膜容受性的具體機(jī)制目前尚不完全清楚，但可以明確的是，子宮內(nèi)膜處在非容受期是導(dǎo)致體外受精-胚胎移植(ivf-et)中胚胎著床失敗的重要原因之一。胚胎移植的成功率是非常重要的，直接關(guān)系到此前付出的所有代價(jià)和成本能夠成功還是功虧一簣。然而，傳統(tǒng)的利用月經(jīng)周期窗口期的方式并不總是可行，甚至對(duì)于相當(dāng)一部分受試者，例如反復(fù)移植失敗的女性，或者罹患其他繼發(fā)性不孕癥的女性，著床窗口期的時(shí)間節(jié)點(diǎn)非常不準(zhǔn)確，如果仍然按月經(jīng)周期或者排卵日推算著床窗口期，會(huì)有很大移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

3、臨床上已經(jīng)有多種判斷內(nèi)膜容受性的方式，例如經(jīng)陰道超聲、血清雌孕激素水平、子宮內(nèi)膜活檢等方法來(lái)判斷子宮內(nèi)膜種植窗的時(shí)間，但均存在一定的誤差。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步、尤其是人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，將基因作為分子標(biāo)志物來(lái)輔助判斷各種生理狀態(tài)和病理狀態(tài)的臨床應(yīng)用越來(lái)越成熟。但是，在子宮內(nèi)膜容受性的預(yù)測(cè)上，已有的方法均存在一顯著的缺點(diǎn)，即它們所用的樣本均來(lái)自對(duì)內(nèi)膜組織進(jìn)行活檢取樣。這種有創(chuàng)的方式給母體帶來(lái)了不必要的損傷，也有潛在的不穩(wěn)定因素，因而降低了受試者的依從性，并且其損傷造成活檢周期無(wú)法進(jìn)行胚胎移植，延長(zhǎng)了受試者的達(dá)孕時(shí)間與art周期。此外，額外操作本身也是一種耗費(fèi)資源、增加受試者痛苦的方式。

4、研究人員都一直在追求更簡(jiǎn)便的、創(chuàng)傷更小的檢查方式，對(duì)于內(nèi)膜容受性預(yù)測(cè)也不例外。臨床上迫切需要一種高效的、無(wú)創(chuàng)的內(nèi)膜容受性診斷方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明簡(jiǎn)述

1、本發(fā)明提供了一種無(wú)創(chuàng)取樣的判斷子宮內(nèi)膜容受性的方法。

2、在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種利用無(wú)創(chuàng)方式獲取待分析活體樣本的方法。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述無(wú)創(chuàng)方式是胚胎預(yù)移植時(shí)移植管壁粘附痕量組織。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述無(wú)創(chuàng)方式是胚胎移植時(shí)移植管壁粘附痕量組織。

3、在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)無(wú)創(chuàng)方式所獲取的樣本中，細(xì)胞數(shù)少于1000個(gè)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，通過(guò)無(wú)創(chuàng)方式所獲取的樣本中，細(xì)胞數(shù)少于900個(gè)、800個(gè)、700個(gè)、600個(gè)、500個(gè)、400個(gè)、300個(gè)或200個(gè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)無(wú)創(chuàng)方式所獲取的樣本中，細(xì)胞數(shù)介于400個(gè)和300個(gè)之間。

4、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括通過(guò)截取加沖洗的方法，將管壁的細(xì)胞、組織轉(zhuǎn)移至樣本采集管中。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣本采集管內(nèi)預(yù)先加入了組織樣本保存液，

5、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括提取樣本中的總rna。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述提取過(guò)程采用億康malbac白金微量rna擴(kuò)增試劑盒(kt110700724)，按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述提取過(guò)程包括以下步驟：a)對(duì)樣本進(jìn)行高速離心，(第一次1600g,2分鐘；第二次3000g，3分鐘；第三次13000rpm，5分鐘)以沉淀全部細(xì)胞。b)去除上清液，加入200μl×2組織樣本保存液重懸細(xì)胞，以3000g離心5分鐘；200μl×1次，留約50μl。c)加入300μl細(xì)胞裂解液，劇烈震蕩30秒至1分鐘；瞬時(shí)離心，棄上清。d)加入350μl現(xiàn)配70％的乙醇后震蕩混勻；瞬時(shí)離心，棄上清。e)加入650μl上述混合液體至吸附柱中，13000×g離心1分鐘，棄離心廢液。f)向吸附柱膜上加入500μl清洗緩沖液，13000×g離心1分鐘，棄離心廢液。g)將100μl?dna消化酶小心滴在吸附柱膜上，25度孵育15分鐘。h)加入500μl清洗緩沖液，13000×g離心1分鐘，棄離心廢液；再次加入500μl的清洗緩沖液于吸附柱上，13000×g離心1分鐘，棄離心廢液。i)向管內(nèi)加入700μl?80％乙醇13000×g離心2分鐘，棄離心廢液；再次13000×g離心1分鐘，棄收集管。j)將吸附柱插入1.5ml離心管中，開(kāi)蓋晾干1分鐘；加入20μl?depc水，25度孵育1分鐘，13000×g離心2分鐘，再重復(fù)1次，共收集40μl洗脫液，即為總rna。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，無(wú)創(chuàng)取樣所獲得的微量樣本中，幾乎全部rna都被抽提出來(lái)，從而為后續(xù)檢測(cè)提供足量的純化rna核酸樣品。

6、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將rna核酸樣品中的mrna逆轉(zhuǎn)錄，生成cdna文庫(kù)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述逆轉(zhuǎn)錄使用億康malbac白金微量rna擴(kuò)增試劑盒(kt110700724)，按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

7、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括進(jìn)一步處理cdna文庫(kù)以構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述進(jìn)一步處理使用使用億康片段化試劑盒(kt100804248)和基因測(cè)序文庫(kù)試劑盒(kt100804048)，按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

8、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括對(duì)所得文庫(kù)實(shí)施測(cè)序。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述測(cè)序的方法是下一代測(cè)序(ngs,next-generation?sequencing)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述測(cè)序的方法是sanger法測(cè)序，或第三代測(cè)序(例如，諸如，納米孔測(cè)序)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明使用illumina?nextseq測(cè)序系統(tǒng)以及配套的next-seq?high-output?kit試劑盒。

9、在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種容受性預(yù)測(cè)模型的建立方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析，并建立容受性預(yù)測(cè)模型的方法。

10、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析包括以下步驟：i)將樣本按照金標(biāo)準(zhǔn)(實(shí)際臨床結(jié)局)分為容受性和非容受性?xún)深?lèi)，并優(yōu)選地拆分為兩個(gè)集合，訓(xùn)練集和測(cè)試集，并取訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步驟；ii)將訓(xùn)練集樣本全部數(shù)據(jù)去噪音、去偏倚，生成分別針對(duì)每個(gè)基因的片段計(jì)數(shù)比對(duì)文件；iii)篩選和收集存在差異表達(dá)的基因，將其作為待鑒定特征；iv)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為tpm，作為每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量數(shù)據(jù)，從而消除樣本下機(jī)數(shù)據(jù)量差異的影響；v)將所述待鑒定特征(基因)的表達(dá)量數(shù)據(jù)輸入機(jī)器學(xué)習(xí)算法，由機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行監(jiān)督學(xué)習(xí)，得到每個(gè)特征對(duì)于判斷容受性的閾值、靈敏度和重要性，從而得到容受性預(yù)測(cè)模型。優(yōu)選地，將所建立的模型在測(cè)試集中進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證。

11、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述模型包括一個(gè)或多個(gè)子模型，不同的子模型包含前述差異表達(dá)基因的全部或不同的部分。

12、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述步驟ii)具體包括：

13、a)對(duì)于每個(gè)樣本的測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行如下處理

14、i.下機(jī)數(shù)據(jù)用trimmomatic(版本0.33)處理，去除接頭序列，過(guò)濾低質(zhì)量reads，

15、產(chǎn)生清洗過(guò)的干凈測(cè)序數(shù)據(jù)

16、ii.將上一步驟產(chǎn)生的干凈的測(cè)序數(shù)據(jù)，用hisat2(版本2.0.5)，比對(duì)到人類(lèi)參考基因組(版本grch38)，產(chǎn)生比對(duì)文件

17、iii.將上一步驟產(chǎn)生的比對(duì)文件進(jìn)行排序，并將重復(fù)序列進(jìn)行標(biāo)記，產(chǎn)生最終的比對(duì)文件

18、iv.將上一步驟產(chǎn)生的比對(duì)文件用htseq_count進(jìn)行處理，該步驟還需要使用一個(gè)基因注釋文件，homo_sapiens.grch38.84.gtf文件，該文件從ensembl下載，其中包含了每個(gè)基因的名字、位置坐標(biāo)等信息，htseq_count可以根據(jù)該信息統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因所在的區(qū)域上有多少序列(對(duì)于雙端測(cè)序，屬于同一片段的reads在統(tǒng)計(jì)時(shí)只計(jì)數(shù)一次)，生成genecount文件

19、b)將一個(gè)批次的所有樣本的genecount文件進(jìn)行合并，生成總的genecount文件，其中每一行是一個(gè)樣本，每一列是一個(gè)基因，其中的數(shù)據(jù)是該樣本中屬于該基因的片段數(shù)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述步驟iii)具體包括以下選取方式：

20、i.排除后續(xù)干擾較大的rrna相關(guān)和線(xiàn)粒體相關(guān)的基因。

21、ii.對(duì)于訓(xùn)練集，進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，將兩類(lèi)樣本中的有差異的基因篩選出來(lái)，得到3193個(gè)基因

22、iii.將上一步篩選到的3193個(gè)基因，進(jìn)一步通過(guò)變量篩選，所得共250個(gè)基因，作為候選feature進(jìn)行下一步模型的訓(xùn)練，詳細(xì)列表見(jiàn)表2。

23、在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述變量篩選為從差異表達(dá)基因中選擇fdr<0.001的基因，得到1270個(gè)基因，利用edger的cpm函數(shù)輸出每個(gè)樣本每個(gè)基因的logtmm值，對(duì)這些基因計(jì)算兩兩之間的pearson相關(guān)性,然后按照如下步驟篩選基因

24、1)將基因按照f(shuō)dr從小到大進(jìn)行排序；

25、2)將列表中最上面的基本標(biāo)記為已選擇；

26、3)將相關(guān)性與與已選擇的基因中的任一基因大于等于0.6的基因標(biāo)記為剔除；

27、4)重復(fù)2)和3)直到列表末尾；

28、5)用篩選得到的基因構(gòu)建模型，用10-fold?cross-validation的方法評(píng)估準(zhǔn)確性，逐次刪除掉對(duì)模型的準(zhǔn)確性無(wú)影響的基因，最后得到250個(gè)基因。

29、在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，上述步驟ii.采用edger(版本3.34.0)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，篩選條件是logfoldchange>0,fdr<0.05，包括以下步驟：

30、a)edger需要兩個(gè)輸入文件，第一個(gè)是genecount文件，其中包含了每個(gè)樣本中每個(gè)基因的reads數(shù)目，第二個(gè)是樣本信息文件，其中包含樣本屬于哪一類(lèi)別；

31、b)edger讀入輸入文件后，首先將每個(gè)樣本中每個(gè)基因的reads數(shù)目進(jìn)行歸一化，歸一化時(shí)選擇了在所有樣本中都有穩(wěn)定表達(dá)的基因；

32、c)edger然后根據(jù)樣本的類(lèi)別信息，尋找在不同的類(lèi)別中表達(dá)有差異的基因，差異的顯著性經(jīng)過(guò)fdr矯正后的p-value表示，p-value越小，差異越顯著。

33、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述步驟iv)具體包括將genecount數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為tpm,以排除樣本下機(jī)數(shù)據(jù)量的影響。計(jì)算公式如下：

34、

35、其中ni是第i個(gè)基因上的reads?count，li是第i個(gè)基因的長(zhǎng)度。

36、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述步驟v)中的機(jī)器學(xué)習(xí)算法為隨機(jī)森林算法。

37、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在拆分出的獨(dú)立的測(cè)試集中對(duì)所建立的容受性預(yù)測(cè)模型的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、roc等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估和/或驗(yàn)證。

38、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在至少兩個(gè)測(cè)試集中對(duì)所建立的容受性預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

39、在第三個(gè)方面，本發(fā)明還提供了生物標(biāo)志物集合，所述生物標(biāo)志物集合用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性，以指導(dǎo)胚胎移植。

40、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合包含上述步驟iii)中鑒定的差異表達(dá)基因中的部分或全部，例如多于5個(gè)和小于等于250個(gè)之間的任意個(gè)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，為了能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性，以指導(dǎo)胚胎移植，本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合包括至少10個(gè)基因成員。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合包括至少11個(gè)基因成員、至少12個(gè)基因成員、至少13個(gè)基因成員、至少14個(gè)基因成員、至少15個(gè)基因成員、至少16個(gè)基因成員、至少17個(gè)基因成員、至少18個(gè)基因成員、至少19個(gè)基因成員、至少20個(gè)基因成員、至少25個(gè)基因成員、至少30個(gè)基因成員、至少35個(gè)基因成員、至少40個(gè)基因成員、至少45個(gè)基因成員、至少50個(gè)基因成員、至少55個(gè)基因成員、至少60個(gè)基因成員、至少65個(gè)基因成員、至少70個(gè)基因成員、至少80個(gè)基因成員、至少90個(gè)基因成員、至少100個(gè)基因成員、至少110個(gè)基因成員、至少120個(gè)基因成員、至少130個(gè)基因成員、至少140個(gè)基因成員、至少150個(gè)基因成員、至少160個(gè)基因成員、至少170個(gè)基因成員、至少180個(gè)基因成員、至少190個(gè)基因成員、至少200個(gè)基因成員、至少210個(gè)基因成員、至少220個(gè)基因成員、至少230個(gè)基因成員、至少240個(gè)基因成員、至少250個(gè)基因成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合包含根據(jù)上述步驟v)中建立的容受性預(yù)測(cè)模型中權(quán)重最高的5個(gè)基因、6個(gè)基因、7個(gè)基因、8個(gè)基因、9個(gè)基因、10個(gè)基因、15個(gè)基因、20個(gè)基因、25個(gè)基因、30個(gè)基因、40個(gè)基因、50個(gè)基因、60個(gè)基因、70個(gè)基因、80個(gè)基因、90個(gè)基因、100個(gè)基因、110個(gè)基因、120個(gè)基因、130個(gè)基因、140個(gè)基因、150個(gè)基因、160個(gè)基因、170個(gè)基因、180個(gè)基因、190個(gè)基因、200個(gè)基因、210個(gè)基因、220個(gè)基因、230個(gè)基因、240個(gè)基因或250個(gè)基因。

41、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合至少包含下列基因：elk4、prkacb、phb2、gm2a、ppa1、nceh1、capg、ddit4、ldhb和tdrd6。

42、在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了基于所述生物標(biāo)志物集合的用途和方法。

43、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述生物標(biāo)志物集合或其特異性檢測(cè)工具用于制備測(cè)定組合物、測(cè)定試劑和/或測(cè)定設(shè)備的用途，所述測(cè)定組合物、測(cè)定試劑和/或測(cè)定設(shè)備用于檢測(cè)和判斷受試者的子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)，其中所述測(cè)定組合物、測(cè)定試劑和/或測(cè)定設(shè)備能夠在來(lái)自受試者的樣品中檢測(cè)上述生物標(biāo)志物集合中每一成員的表達(dá)量；并將表達(dá)量通過(guò)本發(fā)明的容受性預(yù)測(cè)模型進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果用于判斷診斷子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)。

44、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了子宮內(nèi)膜容受性預(yù)測(cè)方法，所述方法包括，利用用于特異性測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的物質(zhì)或方法，獲得所述生物標(biāo)志物集合全部基因成員的表達(dá)量。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的物質(zhì)是組合物、試劑或設(shè)備。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的物質(zhì)是特異性引物和/或探針?lè)肿?。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的組合物或試劑進(jìn)一步包括標(biāo)簽序列、接頭序列、熒光分子、焦磷酸分子和標(biāo)記分子之中的一種或多種。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的方法是pcr方法。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述pcr方法是實(shí)時(shí)熒光定量pcr、恒溫?cái)U(kuò)增pcr等等本領(lǐng)域常用的方法。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的方法是測(cè)序方法。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述測(cè)序方法是下一代測(cè)序(ngs,next-generation?sequencing)、sanger法測(cè)序和第三代測(cè)序(例如，諸如，納米孔測(cè)序)之中的一種或多種。

45、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的試劑不包含特異性檢測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合中的成員以外其他基因的試劑。

46、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于測(cè)定生物標(biāo)志物的水平或其量的方法不測(cè)定本發(fā)明的生物標(biāo)志物集合中的成員以外其他基因的水平或其量。

47、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種子宮內(nèi)膜容受性預(yù)測(cè)方法，所述方法中使用的樣本通過(guò)無(wú)創(chuàng)方式獲取，即，樣本的獲取不對(duì)受試者內(nèi)膜造成損傷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種整合的無(wú)創(chuàng)子宮內(nèi)膜容受性預(yù)測(cè)方法，所述“整合的”意為本方法無(wú)需單獨(dú)額外進(jìn)行，而是在胚胎預(yù)移植或胚胎移植操作時(shí)同時(shí)進(jìn)行，取樣過(guò)程整合在上述操作中，從而取樣周期即為移植周期。如當(dāng)周期移植失敗，且檢測(cè)結(jié)果提示為內(nèi)膜原因，可參考檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)下一個(gè)周期的移植，無(wú)需等待，極大縮短待孕者的達(dá)孕時(shí)間。

48、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于上述方法的試劑盒，所述試劑盒包含用于測(cè)定本發(fā)明的生物標(biāo)志物組合中的每種生物標(biāo)志物在樣品中的水平或其量的試劑，例如特異性試劑和通用試劑。