本發(fā)明屬于有機(jī)合成領(lǐng)域，具體涉及一種核苷酸膠體染料的制備方法。
背景技術(shù)：
1、在分子生物學(xué)研究中，高靈敏度、特異性的核酸檢測(cè)技術(shù)是推動(dòng)基因定量分析與診斷發(fā)展的核心工具。sybr?green?i是一種核苷酸膠體染料，自20世紀(jì)90年代被開(kāi)發(fā)以來(lái)，因其卓越的雙鏈dna(dsdna)結(jié)合特征與低毒性?xún)?yōu)勢(shì)，迅速成為傳統(tǒng)核酸染料(如溴化乙錠，etbr)的重要替代品。此外，多項(xiàng)毒理學(xué)研究證實(shí)，sybr?green?i的致突變性顯著低于etbr，降低了實(shí)驗(yàn)人員的健康風(fēng)險(xiǎn)與環(huán)境污染壓力。
2、sybr?green?i憑借其靈敏度高、毒性低、操作便捷的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr、核酸電泳可視化等領(lǐng)域。此外，在微流控芯片、高通量核酸定量等新興技術(shù)中展現(xiàn)出潛力，sybr?green?i已成為分子檢測(cè)領(lǐng)域的基石工具。但是由于專(zhuān)業(yè)壁壘和工藝復(fù)雜性使得工業(yè)生產(chǎn)僅限專(zhuān)業(yè)廠商，sybr?green?i的合成方法未見(jiàn)報(bào)道。
3、因此，開(kāi)發(fā)一種核苷酸膠體染料sybr?green?i的制備方法成為亟待解決的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種核苷酸膠體染料的制備方法。本發(fā)明提供的制備方法原料簡(jiǎn)單易得，制備方法簡(jiǎn)單，成本低，收率高。
2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
3、一種核苷酸膠體染料的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：化合物a與化合物b發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到化合物c；化合物c與鹵代丙烷發(fā)生取代反應(yīng)，得到所述核苷酸膠體染料sybr?green?i；
4、反應(yīng)路線如下：
5、
6、具體地，化合物c的制備中，所述偶聯(lián)反應(yīng)需要加入堿，所述化合物a、化合物b、所述堿的物質(zhì)的量比為1:(1-1.2):(1.1-1.5)，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度為25-50℃，時(shí)間為2-10h；優(yōu)選地，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度可以為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃等，時(shí)間可以為2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。
7、優(yōu)選地，所述堿包括碳酸鉀、碳酸銫、氫氧化鈉、dbu中的一種。
8、具體地，所述化合物c、鹵代丙烷的物質(zhì)的量比為1:(1.2-1.5)；所述取代反應(yīng)的溫度為25-85℃，時(shí)間為4-16h；優(yōu)選地，所述取代反應(yīng)的溫度可以為25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃或85℃等，時(shí)間可以為4h、6h、8h、10h、12h、14h或16h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。
9、優(yōu)選地，所述鹵代丙烷包括氟丙烷、氯丙烷、溴丙烷和碘丙烷中的一種；
10、優(yōu)選地，所述取代反應(yīng)還需要加入溶劑；
11、更為優(yōu)選地，所述溶劑包括dmf、dmso、thf、乙醇、甲醇中的一種。
12、具體地，所述化合物b的制備包括如下步驟，將2-羥基苯并噻唑與甲基化試劑發(fā)生甲基化反應(yīng)，得到化合物f；化合物f與甲基三苯基溴化膦發(fā)生wittig反應(yīng)，得到化合物b；
13、反應(yīng)路線如下：
14、
15、優(yōu)選地，化合物f的制備還需要在堿和溶劑的作用下進(jìn)行，所述2-羥基苯并噻唑、甲基化試劑和堿的物質(zhì)的量比為1:(1.1-1.5):(1.2-1.6)，所述甲基化反應(yīng)的溫度為回流溫度，時(shí)間為8-14h；優(yōu)選地，所述甲基化反應(yīng)的時(shí)間可以為8h、9h、10h、11h、12h、13h或14h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。
16、優(yōu)選地，所述甲基化試劑包括碘甲烷、硫酸二甲酯中的一種，所述堿包括碳酸鉀、碳酸銫、氫化鈉中的一種，所述溶劑包括乙腈、丙酮、dmf中的一種。
17、優(yōu)選地，化合物b的制備還需要在堿和溶劑的作用下進(jìn)行，所述化合物f、甲基三苯基溴化膦、堿的物質(zhì)的量比為1:(1.1-1.3):(1.2-1.4)，所述wittig反應(yīng)的溫度為-78-0℃，時(shí)間為4-16h；優(yōu)選地，所述wittig反應(yīng)的溫度可以為-78℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-30℃、-20℃、-10℃或-0℃等，時(shí)間可以為4h、6h、8h、10h、12h、14h或16h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。
18、優(yōu)選地，所述堿包括叔丁醇鉀、氫化鈉、氫化鉀、正丁基鋰、叔丁醇鈉中的一種，所述溶劑包括四氫呋喃。
19、具體地，化合物a的制備步驟如下，將2-羥基喹啉與鹵代苯發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到化合物d；化合物d與n,n-二甲基-1,3-丙二胺發(fā)生親核反應(yīng)得到化合物e；化合物e與氧化劑發(fā)生氧化反應(yīng)，得到化合物a；
20、反應(yīng)路線如下：
21、
22、優(yōu)選地，化合物d的制備中，所述偶聯(lián)反應(yīng)還需要加入催化劑、堿和溶劑，所述2-羥基喹啉、鹵代苯、催化劑和堿的物質(zhì)的量比為1:(1.1-1.2):(0.05-0.2):(1.1-1.3)，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度為回流溫度，時(shí)間為8-16h；更為有優(yōu)選地，所述偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間可以為8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h或16h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。
23、優(yōu)選地，所述催化劑包括碘化亞銅、溴化亞銅中的一種，所述堿包括碳酸鉀、碳酸銫中的一種，所述溶劑包括dmf、dmso中的一種，所述鹵代苯包括溴苯、氯苯和碘苯中的一種。
24、優(yōu)選地，化合物e的制備中，所述親核反應(yīng)還需要加入堿和溶劑，所述化合物d、n,n-二甲基-1,3-丙二胺、堿的物質(zhì)的量比為1:(1.1-1.3):(1.2-1.4)，所述親核反應(yīng)的溫度為10-30℃，時(shí)間為2-6h；更為優(yōu)選地，所述親核反應(yīng)的溫度可以為10℃、15℃、20℃、25℃或30℃等，時(shí)間可以為2h、3h、4h、5h或6h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用；
25、優(yōu)選地，所述堿包括碳酸鉀、碳酸銫、氫氧化鈉中的一種，所述溶劑包括乙醇、甲醇、thf中的一種。
26、優(yōu)選地，化合物a的制備中，所述化合物e、氧化劑的物質(zhì)的量比為1:(1.5-10)，所述氧化反應(yīng)的溫度為0-40℃，時(shí)間為8-16h；更為優(yōu)選地，所述氧化反應(yīng)的溫度可以為0℃、10℃、20℃、30℃或40℃等，時(shí)間可以為8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h或16h等，但不限于以上所列舉的數(shù)值，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。
27、優(yōu)選地，所述氧化反應(yīng)中還需要溶劑，所述溶劑包括丙酮、乙酸乙酯、thf中的一種；
28、優(yōu)選地，所述氧化劑包括70％過(guò)氧化叔丁醇水溶液與催化劑的組合、二氧化錳、鉻酐中的一種，所述催化劑包括乙酰丙酮鈷、乙酰丙酮鐵中的一種；
29、更為優(yōu)選的，所述組合中，所述70％過(guò)氧化叔丁醇水溶液與所述催化劑物質(zhì)的量比為(20-100):1。
30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
31、本發(fā)明提供了一種核苷酸膠體染料的制備方法，首次報(bào)道了sybr?green?i的合成方法，該工藝路線合成收率高，路線簡(jiǎn)單，所用原料均為市售試劑，原料便宜易得，能夠?yàn)閟ybr?green?i的大規(guī)模推廣提供理論支持。