1.本發(fā)明公開涉及結(jié)合至血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和血管生成素(例如，血管生成素1和血管生成素2)兩者的融合分子(例如，多肽)、基于這些融合分子的基因療法及其使用方法。

背景技術(shù)：

0、2.背景技術(shù)

1、vegf/vegfr和血管生成素/tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管內(nèi)皮生長(血管生成)過程中以及在血管生成相關(guān)血管的維持中是重要的。參見biela?and?siemann，cancerlett.380(2)：525-533(2016)。異常血管生成涉及一些病況，如糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病，滲出性或“濕性”年齡相關(guān)性黃斑變性(“wamd”)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其它炎性疾病和大部分癌癥。與這些病況相關(guān)的患病組織或腫瘤通常表達(dá)異常高水平的vegf并且顯示出高度的血管形成或血管通透性。例如，wamd是血管生成疾病，其特征為老年個(gè)體中的一只眼或兩只眼中的脈絡(luò)膜新生血管并且是致盲的主要原因。參見gehrs等人，ann?med.38(7)：450-471(2006)。存在用于抑制異常血管生成，靶向vegf或血管生成素的一些治療策略。參見bielaand?siemann，cancer?lett.380(2)：525-533(2016)。然而，這些治療通常需要反復(fù)注射，其可以在一些患者中提高炎癥、感染和其它不利影響的風(fēng)險(xiǎn)。反復(fù)注射還與患者的順從性相關(guān)，并且堅(jiān)持困難和不順從性可以導(dǎo)致視力喪失和眼部疾病或病況的惡化。對于需要關(guān)于施用反復(fù)或頻繁拜訪醫(yī)療辦公室的治療方案的不順從性和不堅(jiān)持的比例在大部分受amd影響的老年患者中特別高。在本領(lǐng)域中，需要改善的治療性分子，具體地在用于治療疾病，如wamd的基因療法中使用的治療性分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、3.發(fā)明概述

1、在一個(gè)方面，本文提供了多肽，其包含：(i)結(jié)合至vegf的第一結(jié)構(gòu)域；(ii)結(jié)合至vegf的第二結(jié)構(gòu)域；和(iii)結(jié)合至血管生成素(例如，血管生成素1和血管生成素2)的第三結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域任選地處于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的n-末端。

2、在一些實(shí)施方式中，第一結(jié)構(gòu)域來源于vegf受體-1(vegfr-1或flt-1)。在一些實(shí)施方式中，第一結(jié)構(gòu)域包含vegfr-1的結(jié)構(gòu)域2或其變體。在一些實(shí)施方式中，第一結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：1所示的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成。在一些實(shí)施方式中，第一結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成。

3、在一些實(shí)施方式中，第二結(jié)構(gòu)域來源于vegf受體-2(vegfr-2或flk-1)。在一些實(shí)施方式中，第二結(jié)構(gòu)域包含vegfr-2的結(jié)構(gòu)域3或其變體。在一些實(shí)施方式中，第二結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：2所示的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成。在一些實(shí)施方式中，第二結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成。

4、在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域(abd)包含seq?id?no：3所示的氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)重復(fù)。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：51所示的氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)重復(fù)。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：3所示的氨基酸序列的兩個(gè)重復(fù)。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：51所示的氨基酸序列的兩個(gè)重復(fù)。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：3所示的氨基酸序列和seq?id?no：51所示的氨基酸序列。

5、在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：4所示的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成，或者第三結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

6、在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：52所示的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成，或者第三結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：52具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

7、在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：53所示的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成，或者第三結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：53具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

8、在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no：54所示的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成，或者第三結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：54具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

9、在另一個(gè)方面，本文提供了多肽，其包含(i)結(jié)合至vegf的第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；(ii)結(jié)合至vegf的第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和(iii)結(jié)合至血管生成素的第三結(jié)構(gòu)域，所述第三結(jié)構(gòu)域包含兩條氨基酸序列，每條序列包含與seq?id?no：3具有至少80％、85％、90％或100％同一性的氨基酸序列。

10、在另一個(gè)方面，本文提供了多肽，其包含(i)結(jié)合至vegf的第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；(ii)結(jié)合至vegf的第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和(iii)結(jié)合至血管生成素的第三結(jié)構(gòu)域，所述第三結(jié)構(gòu)域包含兩條氨基酸序列，每條序列包含與seq?id?no：51具有至少80％、85％、90％或100％同一性的氨基酸序列。

11、在另一個(gè)方面，本文提供了多肽，其包含(i)結(jié)合至vegf的第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；(ii)結(jié)合至vegf的第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和(iii)結(jié)合至血管生成素的第三結(jié)構(gòu)域，所述第三結(jié)構(gòu)域包含一條與seq?id?no：3具有至少80％、85％、90％或100％同一性的氨基酸序列，和一條與seq?id?no：51具有至少80％、85％、90％或100％同一性的氨基酸序列。

12、在一些實(shí)施方式中，所述多肽還包含抗體的fc區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述fc區(qū)包含seq?id?no：5所示的氨基酸序列。

13、在一些實(shí)施方式中，所述多肽還包含信號肽。在一些實(shí)施方式中，所述信號肽包含seq?id?no：6所示的氨基酸序列。

14、在一些實(shí)施方式中，所述多肽還包含一個(gè)或多個(gè)接頭。

15、在一些實(shí)施方式中，本文提供了多肽，其包含seq?id?no：7、seq?id?no：8、seq?idno：9或seq?id?no：10所示的氨基酸序列，或者與seq?id?no：7、seq?id?no：8、seq?id?no：9或seq?id?no：10具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

16、在一些實(shí)施方式中，本文提供了多肽，其包含seq?id?no：58、seq?id?no：59、seqid?no：60、seq?id?no：61、seq?id?no：62、seq?id?no：63、seq?id?no：64、seq?id?no：65或seq?id?no：66所示的氨基酸序列，或者與seq?id?no：58、seq?id?no：59、seq?id?no：60、seqid?no：61、seq?id?no：62、seq?id?no：63、seq?id?no：64、seq?id?no：65或seq?id?no：66具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

17、在一些實(shí)施方式中，本文所提供的多肽還包含vegfc結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述vegfc結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于vegfr-2。在其它實(shí)施方式中，所述vegfc結(jié)合結(jié)構(gòu)域來源于vegfr-3。

18、在一些實(shí)施方式中，所述vegfc結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：55具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

19、在一些實(shí)施方式中，所述vegfc結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：56具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

20、在一些實(shí)施方式中，所述vegfc結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：57具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

21、在一些實(shí)施方式中，所述多肽基因融合或化學(xué)綴合至試劑。

22、在另一個(gè)方面，本文提供了分離的核酸，其包含編碼本文所提供的多肽的核酸序列。

23、在另一個(gè)方面，本文提供了載體，其包含本文所提供的分離的核酸。在一些實(shí)施方式中，所述載體是病毒載體。在一些實(shí)施方式中，所述病毒載體是腺病毒相關(guān)病毒(aav)載體。在一些實(shí)施方式中，所述aav載體來源于aav1、aav2、aav2i8、aav3、aav3-b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav13、aav-dj、aavlk03、aavrh74、aav44-9或其組合或變體。在一些實(shí)施方式中，所述載體是重組aav2(raav2)載體、重組aav8(raav8)載體或其變體。

24、在另一個(gè)方面，本文提供了重組aav(raav)載體，其包含編碼多肽的核酸，其中所述多肽包含(i)來源于vegfr-1的第一結(jié)構(gòu)域；(ii)來源于vegfr-2的第二結(jié)構(gòu)域；和(iii)能夠結(jié)合至血管生成素(例如，血管生成素1和血管生成素2)的第三結(jié)構(gòu)域，其中所述raav載體包含來自下列的末端反向重復(fù)(itr)：aav1、aav2、aav2i8、aav3、aav3-b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav13、aav-dj、aavlk03、aavrh74、aav44-9或其組合或變體。在一些實(shí)施方式中，所述itr來自aav2。在其它實(shí)施方式中，所述itr來自aav8。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域處于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的n-末端。

25、在另一個(gè)方面，本文提供了重組aav(raav)載體，其包含編碼多肽的核酸，其中所述多肽包含(i)來源于vegfr-1的第一結(jié)構(gòu)域；(ii)來源于vegfr-2的第二結(jié)構(gòu)域；和(iii)能夠結(jié)合至血管生成素的第三結(jié)構(gòu)域；和(iv)能夠結(jié)合至vegfc的第四結(jié)構(gòu)域，其中所述raav載體包含來自下列的末端反向重復(fù)(itr)：aav1、aav2、aav2i8、aav3、aav3-b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav13、aav-dj、aav?lk03、aavrh74或aav44-9。在一些實(shí)施方式中，所述itr來自aav2。在其它實(shí)施方式中，所述itr來自aav8。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域處于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的n-末端。

26、在一些實(shí)施方式中，本文提供了載體，所述載體包含seq?id?no：11、seq?id?no：12、seq?id?no：13、seq?id?no：14、seq?id?no：15、seq?id?no：16、seq?id?no：17、seq?idno：18、seq?id?no：19、seq?id?no：20、seq?id?no：21、seq?id?no：22或seq?id?no：23所示的核酸序列，或者與seq?id?no：11、seq?id?no：12、seq?id?no：13、seq?id?no：14、seq?id?no：15、seq?id?no：16、seq?id?no：17、seq?id?no：18、seq?id?no：19、seq?id?no：20、seq?idno：21、seq?id?no：22或seq?id?no：23具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的核酸序列。

27、在一些實(shí)施方式中，本文提供了載體，所述載體包含seq?id?no：67、seq?id?no：68、seq?id?no：69、seq?id?no：70、seq?id?no：71、seq?id?no：72、seq?id?no：73、seq?idno：74或seq?id?no：75所示的核酸序列，或者與seq?id?no：67、seq?id?no：68、seq?id?no：69、seq?id?no：70、seq?id?no：71、seq?id?no：72、seq?id?no：73、seq?id?no：74或seq?idno：75具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的核酸序列。

28、在另一個(gè)方面，本文提供了重組aav(raav)顆粒，其包含(a)編碼多肽的核酸，其中所述多肽包含(i)來源于vegfr-1的第一結(jié)構(gòu)域；(ii)來源于vegfr-2的第二結(jié)構(gòu)域；和(iii)能夠結(jié)合至血管生成素(例如，血管生成素1和血管生成素2)的第三結(jié)構(gòu)域；和(b)下列的衣殼蛋白：aav1、aav2、aav2i8、aav3、aav3-b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav13、aav-dj、aav?lk03、aavrh74、aav44-9或其變體。在一些實(shí)施方式中，第三結(jié)構(gòu)域處于第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的n-末端。在一些實(shí)施方式中，所述衣殼蛋白是aav2衣殼蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述衣殼蛋白是aav8衣殼蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述衣殼蛋白是包含seq?id?no：48所示的氨基酸序列的aav2衣殼蛋白的變體，其中所述變體包含aav2的衣殼蛋白vpl的氨基酸替換y444f、r487g、t491v、y500f、r585s、r588t和y730f。

29、在另一個(gè)方面，本文提供了重組aav(raav)顆粒，其包含(a)編碼多肽的核酸，其中所述多肽包含(i)來源于vegfr-1的第一結(jié)構(gòu)域；(ii)來源于vegfr-2的第二結(jié)構(gòu)域；和(iii)能夠結(jié)合至血管生成素的第三結(jié)構(gòu)域；和(iv)能夠結(jié)合至vegfc的第四結(jié)構(gòu)域；和(b)下列的衣殼蛋白：aav1、aav2、aav2i8、aav3、aav3-b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav13、aav-dj、aav?lk03、aavrh74、aav44-9或其變體。

30、藥物組合物，其包含本文所提供的多肽、載體或raav載體或者raav顆粒和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

31、在另一個(gè)方面，本文提供了治療受試者中疾病或病癥的方法，其包括向所述受試者施用本文所提供的多肽、載體或藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述疾病或病癥是血管生成或新生血管疾病或病癥。在一些實(shí)施方式中，所述疾病或病癥是炎性疾病、眼部疾病、自體免疫疾病或癌癥。在一些實(shí)施方式中，所述疾病或病癥是眼部疾病或病癥。在一些實(shí)施方式中，所述眼部疾病或病癥選自葡萄膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、新生血管型青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病(dr)(包括增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病)、缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、視網(wǎng)膜新血管形成、糖尿病性黃斑水腫(dme)、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血、糖尿病性視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(包括視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞)、黃斑水腫和視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo)后黃斑水腫。在一些實(shí)施方式中，所述疾病或病癥是年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)。在一些實(shí)施方式中，所述amd是濕性amd(wamd)。

32、在一些實(shí)施方式中，所述方法包括通過向受試者眼部玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射的施用。