本發(fā)明涉及基因工程以及害蟲防控，具體涉及一種dsrna/融合dsrna及其在防治葉螨中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、葉螨隸屬隸屬節(jié)肢動物門(arthropoda)，蛛形綱(arachnida)，葉螨總科(tetranychidae)、葉螨屬(tetranychus)，是重要的農(nóng)林害蟲類群之一，極具破壞性，且具有體型小、寄主繁多、適應(yīng)能力和繁殖力極強等特點。葉螨為刺吸式口器昆蟲，通過口針吸取植物葉肉細胞內(nèi)容物，危害后葉片出現(xiàn)白色斑點，且葉螨通常會分泌唾液蛋白抑制寄主植物的防御，并增加同一生態(tài)位其他有害生物的適應(yīng)性，因此造成的損失十分嚴重。生物入侵是我國當前面臨的重要生態(tài)和經(jīng)濟挑戰(zhàn)。外來入侵生物由于其獨特的生長發(fā)育和繁殖特性，能夠快速擴散并取代本地種群，導(dǎo)致防治工作耗時耗力，經(jīng)濟成本高昂。由于難以在入侵早期采取有效治理措施，入侵生物往往會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害。在入侵螨類中，伊氏葉螨和二斑葉螨是典型代表。

2、伊氏葉螨(tetranychusevansi)，又名番茄紅螨，起源于南美洲，寄主范圍廣泛，涵蓋37科138種植物，尤其偏好茄科植物。二斑葉螨(tetranychusurticae)作為廣食性昆蟲，食性雜，寄主植物多達50余科800多種，具有生活周期短、繁殖率高、世代重疊嚴重、環(huán)境適應(yīng)性強等特點。各個發(fā)育階段的葉螨會大量聚集在植物葉片、枝干、果實等進行危害，嚴重時可導(dǎo)致植物葉片、莖稈萎蔫失綠、焦枯甚至死亡，給世界農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前對于葉螨的防治主要以化學防治為主，但農(nóng)藥的不合理使用造成了嚴重的“3r”問題，嚴重威脅著人類的生活質(zhì)量和身體健康。隨著全球氣候變暖和農(nóng)作物栽培方式的改變，單一的化學防治已不能滿足人們對糧食安全的要求，尋找更加綠色有效地防治手段迫在眉睫。

3、rnai(rnainterference)技術(shù)被稱為“農(nóng)藥史上的第三次革命”，是防治病蟲害新型的重要技術(shù)手段。rnai綠色防控技術(shù)的核心理念是將外源(人為)的dsrna注入昆蟲體內(nèi)以抑制靶標基因的表達，導(dǎo)致害蟲的生長發(fā)育障礙或死亡，從而降低有害生物對農(nóng)作物的侵害，實現(xiàn)病蟲害防治。rnai技術(shù)在防治病蟲害上具有防治目標專一性、靶標開發(fā)便捷性、應(yīng)用便捷、操作簡單、綠色無污染等多種優(yōu)勢，符合公眾對綠色農(nóng)藥的需求。目前，在研發(fā)rnai生物農(nóng)藥領(lǐng)域，已有產(chǎn)品上市。2007年，在玉米內(nèi)轉(zhuǎn)化表達玉米根葉甲(diabroticavirgifera)的一種參與能量代謝的關(guān)鍵蛋白(v-atpase)的dsrna，可以有效減少玉米根葉甲對與玉米的危害。僅過了10年，首個商業(yè)化的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米獲得美國環(huán)境保護署(u.sepa)的種植許可，并于2021年獲得中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因安全許可證書。2023年9月29日，美國環(huán)境保護署擬建議批準全球首款基于外源噴灑型的rna干擾(rnai)生物農(nóng)藥ledprona，作為特殊類型的新有效成分，主要用于防治科羅拉多馬鈴薯甲蟲(cpb)，這款dsrna產(chǎn)品通過沉默產(chǎn)生psmb5蛋白所需的cpb基因來殺死害蟲，psmb5蛋白對維持cpb的生命至關(guān)重要，但不會產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。這種基于rnai的農(nóng)藥是世界上第一個允許商業(yè)使用的可噴灑dsrna農(nóng)藥，為確保該產(chǎn)品不對環(huán)境造成不合理的不利影響(包括產(chǎn)品殘留物對人類食品的安全性)，epa已對ledprona進行了全面評估，確定其對人類健康和環(huán)境不存在任何風險，對《瀕危物種法》所列物種沒有影響。

4、葉螨生長發(fā)育的過程是許多基因協(xié)作表達與抑制的過程，隨著研究的深入，大量的rnai靶標基因被發(fā)現(xiàn)。通過干擾葉螨的rnai靶標基因，如vatpase、copb2、aqp9、rpt3、cope、rop、garp1d等，可以顯著降低葉螨的存活率，部分基因可以同時顯著抑制葉螨的繁殖力。目前，利用rnai技術(shù)防治葉螨的研究多集中于單個基因，而葉螨體內(nèi)存在大量的同源基因，rnai靶向單個基因可能會存在互補效應(yīng)，導(dǎo)致防治效果差，效率低，這是葉螨rnai防治中迫切需要解決的問題所在。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種dsrna/融合dsrna及其在防治葉螨中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明為了實現(xiàn)其目的，采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明的第一方面提供一種用于防治葉螨的dsrna，所述dsrna為dsrpt3或者融合dsrna；所述dsrpt3的其中一條鏈的核苷酸序列如seq?id?no.21所示；

4、所述融合dsrna是由靶向葉螨同一基因家族多個基因的dsrna融合得到的；所述基因家族選自蛋白酶體atp酶家族和載脂蛋白家族；

5、所述融合dsrna的其中一條鏈的核苷酸序列如seq?id?no.1～4的任一序列所示。

6、本發(fā)明的第二方面提供上述的用于防治葉螨的dsrna的編碼基因：

7、如seq?id?no.21所示的dsrpt3的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.22所示；

8、如seq?id?no.1～4所示的融合dsrna的編碼基因的核苷酸序列依次為seq?idno.6～9所示。

9、本發(fā)明的第三方面提供上述的dsrna或者上述的編碼基因的下述任一種應(yīng)用：

10、1)在防治葉螨中的應(yīng)用或在制備防治葉螨產(chǎn)品中的應(yīng)用；

11、2)在促進葉螨死亡中的應(yīng)用或在制備促進葉螨死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；

12、3)在抑制葉螨生長中的應(yīng)用或在制備抑制葉螨生長產(chǎn)品中的應(yīng)用；

13、4)在抑制葉螨體內(nèi)融合dsrna對應(yīng)的基因的表達中的應(yīng)用，或在制備抑制葉螨體內(nèi)融合dsrna對應(yīng)的基因的表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

14、所述應(yīng)用為將上述的dsrna導(dǎo)入葉螨，實現(xiàn)抑制葉螨生長、降低葉螨存活率，從而實現(xiàn)防治葉螨。

15、所述dsrna的導(dǎo)入方式為用dsrna飼喂葉螨。

16、所述的應(yīng)用，所述dsrna的工作濃度為800～1200ng/μl。

17、本發(fā)明的第四方面提供含有上述的dsrna的重組表達載體、重組菌或者表達盒。

18、本發(fā)明的第五方面提供含有上述的編碼基因的重組表達載體、重組菌或者表達盒。

19、本發(fā)明的第六方面提供上述的重組表達載體、重組菌或者表達盒的下述任一種應(yīng)用：

20、1)在防治葉螨中的應(yīng)用或在制備防治葉螨產(chǎn)品中的應(yīng)用；

21、2)在促進葉螨死亡中的應(yīng)用或在制備促進葉螨死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；

22、3)在抑制葉螨生長中的應(yīng)用或在制備抑制葉螨生長產(chǎn)品中的應(yīng)用；

23、4)在抑制葉螨體內(nèi)融合dsrna對應(yīng)的基因的表達中的應(yīng)用，或在制備抑制葉螨體內(nèi)融合dsrna對應(yīng)的基因的表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

24、上述的應(yīng)用技術(shù)方案中，所述葉螨包括二斑葉螨和伊氏葉螨。

25、本發(fā)明的有益效果是：提供了dsrna或融合dsrna，對葉螨的致死效果顯著。每一條融合dsrna都針對靶向?qū)?yīng)葉螨某一功能的多條基因，通過飼喂的方式，葉螨取食融合dsrna后抑制多條功能相同的基因表達，從而抑制葉螨生長，死亡率相較于對照組大大提高；且對于二斑葉螨和伊氏葉螨，融合dsrna相較于靶向單個基因的dsrna顯著提高了葉螨的死亡率。

26、本發(fā)明中，dsrna片段設(shè)計選擇基因的保守區(qū)域，可靶向多種葉螨的同源基因(并不局限于二斑葉螨)，設(shè)計出的多個dsrna片段，分析每個dsrna片段的脫靶次數(shù)，選擇對巴氏新小綏螨(葉螨的天敵，在防治害蟲方面發(fā)揮重要作用)、中華蜜蜂(重要的傳粉昆蟲)等生物基因脫靶率低的區(qū)域，以保護巴氏新小綏螨等，維持田間有益生物的種群。

27、相較于目前的防治單一種類的葉螨的dsrna，本發(fā)明的dsrna/融合dsrna能同時防治多種葉螨(例如同時防治二斑葉螨和伊氏葉螨)，有望應(yīng)用于制備防治葉螨的生物農(nóng)藥中，減少化學農(nóng)藥的使用，保護環(huán)境，減少化學農(nóng)藥的傷害。