本發(fā)明屬于植物基因工程，涉及稻瘟病抗病相關(guān)基因oscbp606的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻(oryza?sativa?l.)是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一，超過50％以上人口以水稻為主食，維持水稻的穩(wěn)定生產(chǎn)和供給平衡對(duì)于保障社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展至關(guān)重要。由稻瘟病菌(magnaporthe?oryzae)引起的稻瘟病是水稻病害中最具破壞性的三大病害之一。雖然傳統(tǒng)化學(xué)藥劑在一定程度上能夠抑制稻瘟病的發(fā)生，但其藥物殘留不僅會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞，也可能威脅消費(fèi)者的健康和安全。長期生產(chǎn)實(shí)踐表明，挖掘水稻抗稻瘟病基因，并培育和推廣抗病水稻品種，是一種經(jīng)濟(jì)高效且生態(tài)友好的防控策略。

2、截至目前，研究人員已鑒定出100多個(gè)稻瘟病抗性(r)基因，并成功克隆了30余個(gè)基因。以前r基因的鑒定主要依賴于圖位克隆技術(shù)，通過構(gòu)建f2群體、重組自交系(ril)和加倍單倍體群體等大型分離群體進(jìn)行研究。然而，這種方法因親本之間遺傳多樣性有限，僅能分析兩種等位基因的變異，且構(gòu)建群體過程耗時(shí)耗力，限制了研究效率。

3、隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究者可以以更低的成本對(duì)大量基因組進(jìn)行深度測序，極大推動(dòng)了全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwas)的發(fā)展。gwas為同時(shí)挖掘復(fù)雜表型背后多種遺傳變異提供了強(qiáng)有力的手段。基于水稻綜合hapmap的研究，通過gwas對(duì)稻瘟病抗性進(jìn)行了深入分析，鑒定出多個(gè)與抗病性相關(guān)的基因位點(diǎn)，例如bsr-d1、pb3和pb4等，為稻瘟病抗性研究提供了重要線索。

4、大規(guī)模種質(zhì)資源的抗性鑒定能夠?yàn)榭剐曰蚧騫tl的發(fā)現(xiàn)提供更多可能性，并通過分子標(biāo)記輔助選擇聚合多個(gè)抗性基因或qtl，為提升水稻的廣譜性和持久抗性提供了重要手段。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展和成本的顯著降低，全基因組重測序結(jié)合gwas已廣泛應(yīng)用于植物抗病性研究領(lǐng)域。然而，由于標(biāo)記密度和連鎖不平衡(ld)的限制，gwas難以精準(zhǔn)定位目標(biāo)基因。而轉(zhuǎn)錄組分析通過檢測和比較不同基因型候選基因的表達(dá)水平，可以有效彌補(bǔ)這一不足，從而進(jìn)一步提高抗病基因的鑒定效率。

5、抗病相關(guān)基因的鑒定不僅為深入揭示水稻抗病機(jī)理及其與病原菌的互作機(jī)制提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為抗病品種的培育奠定了重要基礎(chǔ)。通過深入研究這些抗病基因，不僅有助于控制和降低稻瘟病對(duì)水稻生產(chǎn)的危害，還能顯著增強(qiáng)植物的抗病性。這些研究在水稻基因功能解析和抗病育種領(lǐng)域具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606的應(yīng)用。

2、本發(fā)明涉及植物抗性基因的鑒定及克隆，提供了一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)水稻稻瘟病病抗性的新基因oscbp606，該基因位于12號(hào)染色體上，基因座位號(hào)為loc_os12g36910，其全長基因組序列為4325bp(seq?id?no:1)包括5′非翻譯區(qū)(5′utr)、10個(gè)外顯子、9個(gè)內(nèi)含子和3′非翻譯區(qū)(3′utr)。其cdna全長1731bp(seq?id?no：2)，編碼576個(gè)氨基酸。oscbp606編碼的蛋白質(zhì)序列如seq?id?no：3所示。

3、該基因在本發(fā)明涉及的自然群體中分為四種不同的單倍型，該基因缺失會(huì)提高水稻稻瘟病抗性，稻瘟病菌侵染后該基因在抗病和感病種質(zhì)中的表達(dá)量均升高，可以利用水稻種質(zhì)中oscbp606的不同單倍型或結(jié)合crispr/cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯以提高水稻的稻瘟病抗性。

4、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

5、水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606在以下(1)或(2)中的應(yīng)用：

6、(1)在調(diào)控水稻稻瘟病抗性中的應(yīng)用；

7、(2)在培育對(duì)水稻稻瘟病菌易感性或者抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用；

8、其中，所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606編碼的蛋白質(zhì)序列如seq?id?no：3所示。

9、進(jìn)一步地，所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606的全長基因組序列如seq?idno:1所示。

10、進(jìn)一步地，所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606的cdna全長序列如seq?id?no:2所示。

11、進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用(1)為：通過降低、干擾所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606的表達(dá)，或者敲除所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606，增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。

12、進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用(2)為：在水稻中降低、干擾所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606的表達(dá)，或者敲除所述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606，培育獲取對(duì)水稻稻瘟病菌抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻。

13、進(jìn)一步地，所述的降低或干擾通過反義rna、sirna或shrna實(shí)現(xiàn)。

14、進(jìn)一步地，所述的敲除通過crispr/cas9基因編輯載體實(shí)現(xiàn)。

15、進(jìn)一步地，所述的敲除通過包含crispr/cas9基因編輯載體的宿主菌實(shí)現(xiàn)。

16、更進(jìn)一步地，所述的crispr/cas9基因編輯載體的靶序列為：5'-gctcgagtccgccattagcc-3'。

17、用于擴(kuò)增上述水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因oscbp606的引物在水稻稻瘟病抗性鑒別和/或評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)水稻稻瘟病病抗性相關(guān)基因oscbp606受稻瘟病病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量升高，抗病基因型敲除后更能提高稻瘟病抗性。在oscbp606外顯子選定一含有pam序列的20bp作為敲除靶點(diǎn)，與u3-grna表達(dá)盒連接后與cas9構(gòu)建成載體prgeb32s-oscbp606，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染水稻的愈傷組織。潮霉素篩選獲得敲除植株，結(jié)果表明該基因缺失可以顯著提高水稻稻瘟病抗性?？梢岳帽景l(fā)明基因編輯載體prgeb32s-oscbp606用于水稻抗稻瘟病育種中。

19、本發(fā)明發(fā)明人首先通過236份水稻種質(zhì)的水稻稻瘟病抗性全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定到7個(gè)qtl。進(jìn)一步通過參考水稻中參與免疫反應(yīng)的核心基因的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在感病和抗病材料中oscbp606表達(dá)水平在水稻稻瘟病菌侵染后均升高。通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)，單倍型1比單倍型2和單倍型3更加感病。在中花11中敲除該基因，顯著的提高了水稻稻瘟病的抗性，通過sring數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/cgi/input？sessionid＝bmlaimzfq4r6&input_page_show_search＝on)預(yù)測在該基因編碼的蛋白質(zhì)可能與轉(zhuǎn)錄和輸出因子eny2、轉(zhuǎn)錄起始因子tfiid10和nlr蛋白存在互作，通過水稻表達(dá)數(shù)據(jù)庫(https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)發(fā)現(xiàn)，該基因在水稻的各個(gè)部位均有表達(dá)，接種稻瘟病菌后水稻葉片中該基因表達(dá)量升高。

20、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

21、本發(fā)明方法利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)錄組測序分析從水稻中鑒定到了一個(gè)水稻稻瘟病抗性基因oscbp606，通過crispr/cas9基因編輯技術(shù)證實(shí)oscbp606參與了水稻對(duì)稻瘟病病菌的防御反應(yīng)，是一種重要的參與水稻抗病性的負(fù)調(diào)控基因。本發(fā)明有助于更好地了解oscbp606的作用機(jī)制，oscbp606的鑒定為進(jìn)一步了解水稻-病原菌互作奠定了基礎(chǔ)，在育種中有較大的應(yīng)用價(jià)值。