本發(fā)明涉及對(duì)多重耐藥性肺炎克雷伯菌(klebsiella?pneumoniae)，特別對(duì)產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶(ndm)的肺炎克雷伯菌菌株具有強(qiáng)效殺菌活性的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還涉及此類單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在肺炎克雷伯菌感染，特別是肺炎克雷伯菌相關(guān)疾病(klebsiella?pneumoniae?dependent?disease)的治療、預(yù)防和診斷中的用途。

背景技術(shù)：

1、抗微生物藥物耐藥性(antimicrobial?resistance，amr)因其對(duì)全球人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)福祉的影響，已被世界衛(wèi)生組織(world?health?organization)和歐洲藥品管理局(european?medicines?agency)列為全球十大健康優(yōu)先事項(xiàng)之一。在人類病原體中，越來越多的病原體對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性(這一現(xiàn)象被稱為多重耐藥性(multi-drugresistance，mdr))，而肺炎克雷伯菌(本文中亦簡(jiǎn)稱為“kp”)無疑是最常見的mdr病原體。kp既可引起院內(nèi)感染(即，尿路感染、肺炎、傷口和手術(shù)部位感染、敗血癥)，也可引起侵襲性社區(qū)獲得性疾病，例如化膿性肝膿腫、眼內(nèi)炎和腦膜炎。由于產(chǎn)碳青霉烯酶的mdr?kp分離株的出現(xiàn)頻率日益增加，治療往往受到限制，碳青霉烯酶是一類能導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類抗生素(β-內(nèi)酰胺類抗生素的亞類)的耐藥性的酶。在碳青霉烯酶中，新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(newdelhi?metallo-β-lactamases，ndm)的威脅最大，因?yàn)檫@類酶還能導(dǎo)致對(duì)新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑(即，頭孢他啶-阿維巴坦(avibactam)，亞胺培南-瑞來巴坦(relebactam)，以及美羅培南-法硼巴坦(vaborbactam))的耐藥性，而這些復(fù)方制劑被認(rèn)為是最后一道防線。ndm由位于大型多重耐藥質(zhì)粒上的blandm基因編碼，該類質(zhì)粒已在各大洲的高風(fēng)險(xiǎn)mdrkp菌株中廣泛傳播。

2、產(chǎn)ndm菌株備受關(guān)注，因?yàn)樗鼈兊某霈F(xiàn)與特定遺傳特征相關(guān)，這些遺傳特征使該類菌株具備高毒力性狀，從而增加了kp的傳播概率。值得注意的是，自2018年起，意大利托斯卡納持續(xù)導(dǎo)致由ndm-1陽性序列型st147克隆引起的院內(nèi)疫情?？偟貋碚f，st147在印度及東南亞地區(qū)廣泛傳播，并且近期已被歸類為泛耐藥株(pan-drug?resistant)?；蚪M監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，托斯卡納的st147分離株攜帶高度多樣化的質(zhì)粒內(nèi)容物，其編碼mdr和高毒力基因二者。俄羅斯(2017)、英國(guó)(2018-2019)和埃及(2019)也已觀察到類似的基因重排，這些地區(qū)報(bào)道了攜帶雜交質(zhì)粒的不同kp?st(st15、st147、st395和st874)，該質(zhì)粒同時(shí)含有毒力基因和blandm基因。在2019年的德國(guó)疫情中也觀察到類似情況，其中在攜帶blandm-1/blaoxa-48的高黏液性st307分離株中檢測(cè)到了雜交元件。因此，在這些流行克隆株中，賦予mdr和高毒力性狀的遺傳元件出現(xiàn)匯聚，這是一種令人擔(dān)憂的演化發(fā)展，這不僅凸顯了類似克隆株引發(fā)更大規(guī)模流行病的可能性，也迫切要求我們尋找替代性治療策略。

3、人單克隆抗體(human?monoclonal?antibodies，mab)可能成為一種新的強(qiáng)效工具，可快速轉(zhuǎn)化為對(duì)amr的創(chuàng)新性預(yù)防或治療方案。mab的獨(dú)特在于：其能夠靶向特定病原體特有的幾乎無限的抗原庫(kù)(repertoire)；固有地具有良好的安全性并且避免損害宿主的微生物群。

4、然而，仍迫切需要強(qiáng)效、廣譜的抗體治療，以用于kp感染，特別是mdr?kp相關(guān)疾病的治療、預(yù)防和診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了鑒定出對(duì)kp、特別是對(duì)kp的多重耐藥性菌株強(qiáng)效的人mab，發(fā)明人開發(fā)了強(qiáng)大的無偏mab選擇方法，該方法不與特定的預(yù)定抗原結(jié)合，允許從2018年托斯卡納疫情期間經(jīng)歷kp血液感染的患者中分離出人mab，并進(jìn)行了功能性篩查。

2、該策略在實(shí)施例中詳細(xì)公開，允許鑒定在皮摩爾濃度范圍內(nèi)具有強(qiáng)效體外殺菌活性的kp特異性mab，其中最佳候選藥物在體內(nèi)菌血癥模型中對(duì)多重耐藥性kp具有保護(hù)作用。

3、值得注意的是，正如實(shí)施例中將清晰表明的那樣，本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)，選定的靶向st147ndm-1莢膜的mab能夠在吞噬測(cè)定中促進(jìn)細(xì)菌攝取，并引發(fā)鏈?zhǔn)?enchained)細(xì)菌生長(zhǎng)，這與它們?cè)隗w內(nèi)防御血流感染的能力相關(guān)。

4、在某些方面，本發(fā)明因此提供了特異性結(jié)合kp表面抗原的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。

5、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合kp的耐藥性或多重耐藥性菌株的表面抗原，特別是產(chǎn)新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(ndm)的kp菌株。

6、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至少一種肺炎克雷伯菌莢膜型k64菌株的表面抗原。

7、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合肺炎克雷伯菌序列型147(st147)的表面抗原。在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至少一種kp菌株的莢膜抗原(本文中也稱為k抗原)或o抗原。

8、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合至少一種以下菌株的莢膜抗原并針對(duì)其有殺菌作用：ndm-1陽性肺炎克雷伯菌序列型147(st147)菌株和ndm-9陽性肺炎克雷伯菌序列型147(st147)菌株。

9、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合ndm-1陽性肺炎克雷伯菌序列型147(st147)菌株的莢膜抗原并對(duì)其具有殺菌作用。

10、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合肺炎克雷伯菌的表面抗原，其包含選自由以下組成的組的單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)：sbj08-o09、sbj08-d18、sbj03-f18、sbj03-l02、sbj05-b17、sbj05-c11、sbj05-d08、sbj05-d14、sbj05-k07、sbj05-m13、sbj05-n02、sbj08-f04、sbj08-h10、sbj08-j10、sbj08-k19、sbj08-m13、sbj08-n23、sbj08-o03、sbj09-g14、sbj09-i10、sbj09-m06、sbj10-h18、sbj11-c06、sbj11-j13。

11、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合肺炎克雷伯菌的表面抗原的區(qū)域，其包含選自由以下組成的組的單克隆抗體的cdr：sbj08-o09、sbj08-d18、sbj03-f18、sbj03-l02、sbj05-b17、sbj05-c11、sbj05-d08、sbj05-d14、sbj05-k07、sbj05-m13、sbj05-n02、sbj08-f04、sbj08-h10、sbj08-j10、sbj08-k19、sbj08-m13、sbj08-n23、sbj08-o03、sbj09-g14、sbj09-i10、sbj09-m06、sbj10-h18、sbj11-c06、sbj11-j13。

12、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合kp的表面抗原的區(qū)域，其包含在氨基酸序列上分別與選自由以下組成的組的單克隆抗體的vl和vh結(jié)構(gòu)域至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的vl和vh結(jié)構(gòu)域：sbj08-o09、sbj08-d18、sbj03-f18、sbj03-l02、sbj05-b17、sbj05-c11、sbj05-d08、sbj05-d14、sbj05-k07、sbj05-m13、sbj05-n02、sbj08-f04、sbj08-h10、sbj08-j10、sbj08-k19、sbj08-m13、sbj08-n23、sbj08-o03、sbj09-g14、sbj09-i10、sbj09-m06、sbj10-h18、sbj11-c06、sbj11-j13。

13、在某些方面，本發(fā)明提供了人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其與本文公開的任何抗體競(jìng)爭(zhēng)kp的表面抗原。

14、在某些方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的人單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，用于預(yù)防性或治療性治療kp感染、優(yōu)選根據(jù)本文公開的任何變體的肺炎克雷伯菌莢膜型k64菌株的感染，或由此類感染引起的病癥或疾病。

15、在某些方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的人單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，用于預(yù)防性或治療性治療kp感染、優(yōu)選根據(jù)本文公開的任何變體的肺炎克雷伯菌莢膜型k64菌株的感染，或由此類感染引起的病癥或疾病。

16、在某些方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療kp感染或由此類感染導(dǎo)致的病癥或疾病的方法，包括向有需要的受試者施用根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的人單克隆抗體或抗原結(jié)合部分。

17、本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的人單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其用于診斷、預(yù)防和/或治療患有kp感染或有發(fā)生kp感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者，所述感染優(yōu)選為根據(jù)本文公開的任何變體的肺炎克雷伯菌莢膜型k64菌株的感染。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人結(jié)合分子和/或核酸分子在診斷/檢測(cè)此類感染中的用途。

18、在某些方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的至少一種或更多種人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分和藥學(xué)上可接受的載體，以及其在預(yù)防和/或治療kp感染、優(yōu)選根據(jù)本文公開的任何變體的肺炎克雷伯菌莢膜型k64菌株的感染，或由此類感染引起的病癥或疾病中的用途。

19、在某些方面，本發(fā)明提供了分離的細(xì)胞系，其產(chǎn)生根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的抗體或其抗原結(jié)合部分。

20、在某些方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的抗體或其抗原結(jié)合部分的核苷酸序列。

21、在某些方面，本發(fā)明提供了載體，其包含編碼根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子，其中載體可選地包含可操作地連接到核酸分子的表達(dá)控制序列。

22、在某些方面，本發(fā)明提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)任何前述實(shí)施方案的核酸，其中非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述核酸。在某些實(shí)施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。

23、在某些方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在診斷kp感染中的用途。

24、在某些方面，本發(fā)明提供了用于揭示樣品中肺炎克雷伯菌的存在的體外方法，包括以下步驟：

25、i)接觸根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的抗體或其抗原結(jié)合部分；

26、ii)檢測(cè)所述抗體或其抗原結(jié)合部分與kp的表面抗原的結(jié)合，優(yōu)選地檢測(cè)所述抗體或其抗原結(jié)合部分與肺炎克雷伯菌莢膜抗原、更優(yōu)選k64型莢膜抗原的結(jié)合。

27、在某些方面，本發(fā)明提供了用于診斷受試者的kp感染的體外方法，包括以下步驟：

28、i)將根據(jù)本文公開的任何實(shí)施方案的抗體或其抗原結(jié)合部分與所述受試者的生物樣品接觸；

29、ii)檢測(cè)所述抗體或其抗原結(jié)合部分與kp的表面抗原的結(jié)合，優(yōu)選地檢測(cè)所述抗體或其抗原結(jié)合部分與肺炎克雷伯菌莢膜抗原、更優(yōu)選k64型莢膜抗原的結(jié)合。

30、本發(fā)明構(gòu)想了本發(fā)明前述方面和實(shí)施方案的任意組合。