本公開總體上涉及生物。具體地，本發(fā)明涉及用于表達和純化具有極小n-端起始子甲硫氨酸的重組蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒、方法和組合物。

背景技術(shù)：

1、dna結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和重組dna技術(shù)的發(fā)展引發(fā)了工業(yè)生物技術(shù)的革命。傳統(tǒng)微生物學技術(shù)與分子生物學相結(jié)合、以產(chǎn)生改進的重組工藝，用于初級和次級代謝物、蛋白質(zhì)生物制藥和工業(yè)酶的工業(yè)生產(chǎn)。重組dna技術(shù)已經(jīng)證明了，通過控制靶基因的表達可以改善工業(yè)合成的蛋白質(zhì)的理想特性。

2、由于生物技術(shù)和生物制品的獨特生物合成生產(chǎn)工藝和分子特性，藥物物質(zhì)(drugsubstance)包括多個分子實體或變體；因此，所需產(chǎn)品可以是預(yù)期的翻譯后修飾形式(例如，糖型)的混合物。在藥物物質(zhì)或藥物產(chǎn)品的制造和/或儲存過程中也可能產(chǎn)生異質(zhì)性。這些形式可能是活性的/非活性的，并且它們的存在可能對生物制品的安全性和有效性產(chǎn)生有害影響。

3、蛋白質(zhì)合成在原核生物中由甲酰甲硫氨酸(n-端甲硫氨酸)啟動，在真核生物中由甲硫氨酸啟動。在重組蛋白質(zhì)的表達過程中，n-端甲硫氨酸由內(nèi)源性甲硫氨酸氨基肽酶(methionine?aminopeptidase，map)共同翻譯裂解。所述裂解過程是無效的，因為表達的重組蛋白質(zhì)的量超過了有限量的map裂解n-端甲硫氨酸的能力，因此大量表達的重組蛋白質(zhì)含有作為第一氨基酸(n-端起始子甲硫氨酸)的甲硫氨酸，它不是成熟蛋白質(zhì)的一部分。

4、此外，具有n-端起始子甲硫氨酸的重組蛋白質(zhì)在生產(chǎn)和儲存過程中容易發(fā)生氧化，并且必須仔細觀察和保護這種氧化。當?shù)鞍踪|(zhì)中的甲硫氨酸殘基被氧化時，可以生成甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。甲硫氨酸氧化可能會導(dǎo)致免疫原性、非活性和聚集性的增加。甲硫氨酸氧化可能會限制治療產(chǎn)品的臨床療效、穩(wěn)定性和監(jiān)管接受度。

5、具有n-端甲硫氨酸雜質(zhì)的生物制品可能不具有與天然蛋白質(zhì)相同的結(jié)構(gòu)、活性和穩(wěn)定性；并且因此，當施用于人類受試者時，可能導(dǎo)致受試者的不期望的免疫響應(yīng)，從而導(dǎo)致無效的治療功能。因此，在配制之前從生物制品中去除甲硫氨酸雜質(zhì)或使甲硫氨酸雜質(zhì)極小化是非常重要的。

6、為了制備具有先天n-端的重組蛋白質(zhì)，人們進行了各種嘗試來去除n-端甲硫氨酸。主要地，使用溴化氰在極酸性條件下裂解n-端甲硫氨酸，但該方法限于不含任何內(nèi)部甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)。另外，使用極端酸性條件可能會對目的蛋白質(zhì)(protein?ofinterest)產(chǎn)生有害影響，并且因此需要探索去除n-端甲硫氨酸的替代方法。

7、過去研究人員采用的其他策略包括改變第二位置(與甲硫氨酸相鄰的位置)處的氨基酸以有效裂解甲硫氨酸，但所述策略可能導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)和功能變化，從而產(chǎn)生具有不良影響的改變后的分子。

8、另外，研究人員還實驗了用純化后的甲硫氨酸氨基肽酶(miller等人，1987)進行體外消化，以去除n-端甲硫氨酸。然而，所述方法需要額外的純化步驟和酶成本，因此在經(jīng)濟上不可行。

9、n-端甲硫氨酸可以通過酶甲硫氨酸氨基肽酶(map)共翻譯裂解。在真核生物中，甲硫氨酸是通過用于分泌的n-端信號肽的裂解或通過map去除的。在原核生物中，甲酰甲硫氨酸首先被甲酰甲硫氨酸去甲酰酶去除，產(chǎn)生n-端甲硫氨酸，然后由map處理。在大腸桿菌中，僅存在一個map基因拷貝，該拷貝負責去除大腸桿菌中表達的70％蛋白質(zhì)的n-端甲硫氨酸。特別是在大腸桿菌中，隨著重組蛋白質(zhì)的大規(guī)模地表達，n-端甲硫氨酸保留在約30％的被表達蛋白質(zhì)(expressed?protein)中，這可能是因map飽和而導(dǎo)致的。(參考：paulwingfield等人,2018“n-terminal?methionine?processing”)；并且因此，研究人員將興趣集中在經(jīng)由大腸桿菌的基因操作的map共表達上。各種啟動子的組合已經(jīng)用于map和目的蛋白質(zhì)的共表達，以用于去除甲硫氨酸雜質(zhì)。

10、在大腸桿菌中表達的(非格司亭(filgrastim)，r-met-hug-csf)重組蛋白質(zhì)已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(usfda)批準，該用于化學療法期間中或化學療法之后患有嗜中性白血球減少癥的患者。由長度為175個氨基酸的多肽鏈構(gòu)成(souza等人,1986年；lu等人,1989b年)構(gòu)成。蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的直接表達導(dǎo)致大量表達后的制品在包涵體中積累。據(jù)報道，典型的生產(chǎn)批次包含非常低(～1％)水平的甲酰甲硫氨酸-g-csf(formylmethionine–g-csf，f-metg-csf)。同樣地，氧化形式占總的不到2％。[參考：alan?c.herman等人research?titled“characterization,formulation,and?stability?of(filgrastim),a?recombinant?humangranulocyte?colony?stimulating?factor?published?in?formulation,characterization,and?stability?of?protein?drugs,rodney?pearlman和y.john?wang,eds.,plenum?press,new?york,1996]。

11、美國專利us6071718a公開了使用表達map的tac啟動子和表達目的基因的t7啟動子。此篇專利還公開了使用甲硫氨酸氨基肽酶裂解被表達的蛋白質(zhì)(β酪蛋白)的n-端氨基酸。該專利進一步公開了亞氨肽酶和氨基肽酶的表達要求以及使用兩種脯氨酸氨基酸有效裂解甲硫氨酸起始子的要求。添加兩個脯氨酸可能會在被表達的蛋白質(zhì)的n-端增加不需要的雜質(zhì)或側(cè)翼氨基酸。向重組蛋白質(zhì)添加氨基酸可能會進一步改變表達后的分子的結(jié)構(gòu)和功能。

12、美國專利us11060123b2公開了使用表達map的tac啟動子和表達目的基因的t7啟動子。在所述專利中，map基因被插入到大腸桿菌的基因組中，從而僅通過使用所述經(jīng)修飾的宿主、更具體地大腸桿菌(僅bl21?gormet菌株)來限制目的蛋白質(zhì)的表達。進一步地，僅有一個map拷貝被整合到基因(gor)的單個位置中以作為替代，該基因還攜帶額外的氯霉素基因以供選擇，從而限制了map在被表達的蛋白質(zhì)中裂解和去除n-端甲硫氨酸的可用性。由于大腸桿菌基因組被重新工程化，所述方案限制了對特定大腸桿菌菌株的應(yīng)用，并且因此不能用于在其他大腸桿菌菌株中蛋白質(zhì)的表達。

13、歐洲專利ep2430041b1公開了一種具有141個氨基酸的經(jīng)修飾的凝集素蛋白，該經(jīng)修飾的凝集素蛋白使用重組dna技術(shù)在大腸桿菌中表達為穩(wěn)定且可溶解的蛋白質(zhì)。所述經(jīng)修飾的凝集素在糖結(jié)合特異性和凋亡特性方面與天然凝集素相似，使它們能夠用作癌癥治療的藥物輸送劑和作為診斷工具的應(yīng)用。

14、大量純化后的重組蛋白質(zhì)含有作為第一氨基酸的甲硫氨酸，它不是成熟蛋白質(zhì)序列的一部分，即，大多數(shù)治療性蛋白質(zhì)不需要的部分。目前，尚無普遍接受的策略來有效或完全去除工業(yè)規(guī)模表達的重組蛋白質(zhì)中的n-端甲硫氨酸。因此，尋求具有高表達率/產(chǎn)量、極小雜質(zhì)和簡化的純化過程的蛋白質(zhì)表達策略。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本公開涉及用于表達和純化具有極小n-端起始子甲硫氨酸的重組蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒、方法和組合物。進一步地，本發(fā)明提供了用于以工業(yè)規(guī)模表達的重組蛋白質(zhì)中有效或完全去除n-端起始子甲硫氨酸的策略。本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包括用于表達甲硫氨酸氨基肽酶(map)的dna構(gòu)建體，該甲硫氨酸氨基肽酶map能夠有效去除被表達的蛋白質(zhì)中的n-端起始子甲硫氨酸。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)具有極小n-端起始子甲硫氨酸的蛋白質(zhì)的方法。

2、在一個方面中，本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包括：

3、編碼甲硫氨酸氨基肽酶(map)蛋白質(zhì)或其變體的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到seq?id?no?5的啟動子序列；以及

4、編碼的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到seq?id?no?7的啟動子序列；

5、其中，重組質(zhì)粒作用于目的蛋白質(zhì)，該目的蛋白質(zhì)由少于2％的n-端起始子甲硫氨酸構(gòu)成。

6、在本發(fā)明的另一方面，重組質(zhì)粒是經(jīng)修飾的pet27b質(zhì)粒。

7、在本發(fā)明的另一方面，map蛋白質(zhì)或其變體進一步可操作地連接到終止子。

8、在本發(fā)明的另一方面，目的蛋白質(zhì)進一步可操作地連接到終止子。

9、在本發(fā)明的另一方面，編碼map蛋白質(zhì)的、可操作地連接到啟動子序列的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

10、在本發(fā)明的另一方面，目的蛋白質(zhì)是seq?id?no:10的蛋白質(zhì)。

11、在本發(fā)明的另一方面，目的蛋白質(zhì)是seq?id?no:13或seq?id?no:16的蛋白質(zhì)。

12、在本發(fā)明的另一方面，map蛋白質(zhì)是seq?id?no:4或其變體的蛋白質(zhì)。

13、在本發(fā)明的另一方面，目的蛋白質(zhì)可以用于癌癥診斷或癌癥治療。

14、在另一實施方案中，本發(fā)明涉及重組質(zhì)粒的用途以用于生產(chǎn)具有少于2％的n-端起始子甲硫氨酸的目的蛋白質(zhì)。

15、在本發(fā)明的另一實施方案中，編碼目的蛋白質(zhì)的、可操作地連接到啟動子的核苷酸序列如圖4所示。

16、在又一方面，本發(fā)明涉及seq?id?no:18的重組質(zhì)粒，其中，該質(zhì)粒進一步包括編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到seq?id?no:7的啟動子序列。

17、在又一方面，本發(fā)明涉及包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒的宿主細胞，其中，該宿主細胞是原核生物。

18、在本發(fā)明的又一方面中，原核生物是大腸桿菌de3菌株。

19、在又一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟：

20、a)向宿主細胞提供根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒；

21、b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；

22、c)從培養(yǎng)后的宿主細胞或培養(yǎng)基純化目的蛋白質(zhì)；并且

23、其中，純化后的蛋白質(zhì)由少于2％的n-端起始子甲硫氨酸構(gòu)成。

24、在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包括：

25、seq?id?no:3的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到seq?id?no:5的啟動子序列和終止子序列；以及

26、編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到seq?id?no?7的啟動子序列和終止子序列；

27、其中，重組質(zhì)粒作用于目的蛋白質(zhì)，該目的蛋白質(zhì)由少于2％的n-端起始子甲硫氨酸構(gòu)成。