本發(fā)明屬于魚類生殖干細胞分離，具體涉及一種中華鱘精原干細胞的分離和移植方法。
背景技術(shù)：
1、目前野生種群數(shù)量極度瀕危，由于過度捕撈、棲息地破壞及水體污染等因素，其自然繁殖已連續(xù)多年中斷，物種延續(xù)面臨嚴峻挑戰(zhàn)。中華鱘是古老的珍稀魚類，至今已存活1.4億年，具有極高的生態(tài)、科研和文化價值，它是長江水域生態(tài)健康的關(guān)鍵指示物種，也對研究魚類演化及生物適應(yīng)性有重要意義。
2、通過體外培養(yǎng)、保存和移植精原干細胞，可望實現(xiàn)瀕危魚類的生殖細胞保存與人工種群重建，為保護中華鱘遺傳資源、突破人工繁殖瓶頸提供新的技術(shù)途徑，是種質(zhì)資源保存的前沿方向。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、基于此，本發(fā)明的目的是提供一種中華鱘精原干細胞的分離方法，以中華鱘為鱘魚及長江魚類的代表，根據(jù)中華鱘精原干細胞的物理特性，采用percoll密度梯度離心得到高純度的精原干細胞并移植，為保護中華鱘遺傳資源、突破人工繁殖瓶頸提供新的技術(shù)途徑。
2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
3、本發(fā)明提出一種中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，包括以下步驟：
4、(1)中華鱘精巢組織用含有青霉素/鏈霉素雙抗的l-15培養(yǎng)基洗滌，物理剪切、消化酶解和篩網(wǎng)過濾，得到中華鱘精巢細胞懸液；
5、(2)所述中華鱘精巢細胞懸液加入到percoll密度梯度離心體系中，進行percoll密度梯度離心，得到中華鱘精原干細胞；
6、(3)所述中華鱘精原干細胞經(jīng)活細胞熒光膜染色，洗滌，重懸細胞，通過顯微注射移植進入受體魚幼魚性腺原基生殖脊部位。
7、作為優(yōu)選，步驟(1)中，操作過程包括：無菌環(huán)境下，取1-2g的1-3齡中華鱘精巢組織，用含有3％青霉素/鏈霉素雙抗的l-15培養(yǎng)基清洗，清洗后的精巢組織用剪刀剪碎，再加入由含胰蛋白酶、膠原酶、胎牛血清(fbs)和dnase?i的l-15培養(yǎng)基配制的酶解液中，在搖床中于25℃、130rpm/min消化酶解3.5h，然后依次通過150μm和50μm的細胞濾網(wǎng)濾掉組織殘塊，加入10％?fbs終止解離，得到中華鱘精巢細胞懸液。
8、作為更優(yōu)選，步驟(1)中，所述酶解液的組成包括：含有0.25％胰蛋白酶、4mg/ml膠原酶h、10％?fbs和0.05％?dnase?i的l-15培養(yǎng)基。
9、作為優(yōu)選，步驟(2)中，操作過程包括：將所述中華鱘精巢細胞懸液加入到percoll密度梯度離心體系中，室溫800×g離心30min；其中，所述percoll密度梯度離心體系的配制過程包括：先用10×pbs稀釋percoll原液至工作液濃度，再用pbs稀釋percoll至不同密度梯度層級，然后加入dnase?i防止細胞聚團，最后混合各層級，得到中華鱘精原干細胞。
10、作為更優(yōu)選，步驟(2)中，所述不同密度梯度層級包括20％、25％、30％、35％、40％、50％的密度梯度層級。
11、作為優(yōu)選，步驟(3)中，操作過程包括：取出各層級細胞懸液，保留25％和30％層級并混合，加入5倍體積的l-15培養(yǎng)基清洗兩遍，去除殘留percoll分離培養(yǎng)基，用含有10％fbs和0.01％?dnase?i的l-15培養(yǎng)基重懸細胞，所得細胞懸液置于冰上保存。
12、作為優(yōu)選，步驟(3)中，操作過程包括：向所述中華鱘精原干細胞中加入1ml?pbs重懸，再加入2μl?cm-dil活細胞熒光膜染料原液對精原干細胞進行染色標記；染色后的精原干細胞加入5ml?pbs進行洗滌，300×g離心15min，重復(fù)兩次以完全洗去殘留的cm-dil活細胞熒光膜染料，加入含有5％?fbs和0.01％?dnasei的l-15培養(yǎng)基，得到精原干細胞懸液，通過顯微注射移植進入受體魚幼魚性腺原基生殖脊部位。
13、作為更優(yōu)選，步驟(3)中，所述精原干細胞的染色標記流程包括：先在28℃染色15min，再在4℃染色10min，染色過程全程避光。
14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
15、一、本發(fā)明以中華鱘為鱘魚及長江魚類的代表，提出一種中華鱘精原干細胞的分離方法，先通過物理剪切和生物酶解得到中華鱘精巢細胞懸液，然后根據(jù)中華鱘精原干細胞的物理特性，采用percoll密度梯度離心將其從細胞懸液中特異分離，得到高純度的精原干細胞，用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、借腹生殖等有望實現(xiàn)瀕危魚類的生殖細胞保存與人工種群重建，為保護中華鱘遺傳資源和突破人工繁殖瓶頸提供新的技術(shù)途徑。
16、二、本發(fā)明中中華鱘精原干細胞的分離方法具有操作簡單、設(shè)備門檻低等優(yōu)勢，分離得到的中華鱘精原干細胞活力好、純化度高且方便后續(xù)操作。
1.一種中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(1)中，無菌環(huán)境下，取1-2g的1-3齡中華鱘精巢組織，用含有3％青霉素/鏈霉素雙抗的l-15培養(yǎng)基清洗，清洗后的精巢組織用剪刀剪碎，再加入由含胰蛋白酶、膠原酶、fbs和dnase?i的l-15培養(yǎng)基配制的酶解液中，在搖床中于25℃、130rpm/min消化酶解3.5h，然后依次通過150μm和50μm的細胞濾網(wǎng)濾掉組織殘塊，加入10％fbs終止解離，得到中華鱘精巢細胞懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(1)中，所述酶解液的組成包括：含有0.25％胰蛋白酶、4mg/ml膠原酶h、10％fbs和0.05％dnasei的l-15培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(2)中，將所述中華鱘精巢細胞懸液加入到percoll密度梯度離心體系中，室溫800×g離心30min，然后加入dnase?i防止細胞聚團，混合各層級，得到中華鱘精原干細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，所述percoll密度梯度離心體系的配制過程包括：先用10×pbs稀釋percoll原液至工作液濃度，再用pbs稀釋percoll工作液至不同密度梯度層級。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(2)中，所述不同密度梯度層級包括20％、25％、30％、35％、40％、50％的密度梯度層級。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(3)中，取各層級細胞懸液，保留25％和30％層級并混合，加入5倍體積的l-15培養(yǎng)基清洗，去除殘留percoll分離培養(yǎng)基，用含有10％fbs和0.01％dnase?i的l-15培養(yǎng)基重懸細胞，所得細胞懸液置于冰上保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(3)中，向所述中華鱘精原干細胞中加入1ml?pbs重懸，再加入2μl?cm-dil活細胞熒光膜染料原液對精原干細胞進行染色標記；染色后的精原干細胞加入5ml?pbs進行洗滌，300×g離心15min；重復(fù)上述操作步驟，直至完全洗去殘留的cm-dil活細胞熒光膜染料，加入含有5％fbs和0.01％dnasei的l-15培養(yǎng)基，得到精原干細胞懸液，通過顯微注射移植進入受體魚幼魚性腺原基生殖脊部位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述中華鱘精原干細胞的分離和移植方法，其特征在于，步驟(3)中，所述精原干細胞的染色標記流程包括：先在28℃染色15min，再在4℃染色10min，染色過程全程避光。