本發(fā)明涉及一種酶活性提高的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于酶工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶（reticuline?7-o-methyltransferase）是一種催化牛心果堿c7位羥基甲基化的氧甲基轉(zhuǎn)移酶，是芐基異喹啉類(lèi)生物堿合成過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶，催化產(chǎn)物去勞丹堿（laudanidine）是罌粟堿和嗎啡的前體化合物，對(duì)相關(guān)芐基異喹啉類(lèi)生物堿的生物合成起著重要作用。

2、來(lái)源于粉防己的一條牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了含有牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌重組菌株，實(shí)現(xiàn)了牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白表達(dá)和體外酶催化活性驗(yàn)證，證實(shí)了該牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶具有催化牛心果堿的c7位羥基甲基化的功能，為相關(guān)代謝產(chǎn)物的生物合成提供了一條牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶學(xué)元件，但是經(jīng)體外催化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)同時(shí)產(chǎn)生催化烏藥堿和氮甲基烏藥堿c7位羥基催化作用（以催化牛心果堿為主)，牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶催化活性偏低，尤其r-牛心果堿轉(zhuǎn)化率低，嚴(yán)重限制了相關(guān)代謝產(chǎn)物的催化合成。

3、本發(fā)明基于前期已構(gòu)建的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶重組質(zhì)粒，通過(guò)點(diǎn)突變改變蛋白質(zhì)的腔體通道和內(nèi)部的疏水性，經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶酶活的提高和立體選擇性的改變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于利用從藥用植物粉防己中鑒定的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，利用大腸桿菌對(duì)該基因進(jìn)行異源重組表達(dá)，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得酶活性提高的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明利用來(lái)源于藥用植物粉防己的野生型牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（氨基酸序列如seq?id?no.1所示），通過(guò)大腸桿菌異源表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了c7羥基甲基化的催化功能驗(yàn)證。此外，本發(fā)明還提供一種提高牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶活力的方法，是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第251位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔缓突驅(qū)?36位纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼?；和或?qū)⒌?37位的亮氨酸分別突變?yōu)楸奖彼帷Ｋ鐾蛔凅w選自如下的任一種：

4、m251i：將第251位蛋氨酸定向突變?yōu)楫惲涟彼幔?/p>

5、v236m：將第236位纈氨酸分別定向突變?yōu)榈鞍彼幔?/p>

6、l237f：將第237位亮氨酸分別定向突變?yōu)楸奖彼幔?/p>

7、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將含有編碼牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因與載體pet-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 e.?coli?bl21(de3)。挑選轉(zhuǎn)化子接種到帶卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12?h，轉(zhuǎn)接到新的抗性培養(yǎng)基中，接種量為1%。待菌體長(zhǎng)到od600為0.6-0.8時(shí)，加入iptg誘導(dǎo)，并將培養(yǎng)溫度降到16℃，培養(yǎng)24?h。收集上清，純化獲得牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體(r7omt)。

8、本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方式，將牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶分子內(nèi)部疏水性的氨基酸蛋氨酸突變成疏水性強(qiáng)的異亮氨酸，且將疏水強(qiáng)的氨基酸纈氨酸突變成弱疏水性氨基酸蛋氨酸、和將疏水的氨基酸亮氨酸突變成疏水性更強(qiáng)的苯丙氨酸，這是因?yàn)楸交哂懈鼜?qiáng)的電子親和力和π電子共軛效應(yīng)，可以更好地吸引水分子，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的疏水性。改變了整體分子內(nèi)部疏水性和底物相互作用，并且重塑了底物口袋腔，顯著提高菌株表達(dá)牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活性，并將牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶活最大提高了約18倍。

1.一種酶活性提高的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于：是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的氧甲基轉(zhuǎn)移酶第251位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔蛯?36位纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼?，和將?37位的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶活性提高的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

3.一種重組基因工程菌，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的酶活性提高的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體，所述的工程菌為大腸桿菌e.?coli?bl21。

4.一種權(quán)利要求1所述的酶活性提高的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體在芐基異喹啉類(lèi)生物堿合成中應(yīng)用。

5.一種權(quán)利要求3所述的重組基因工程菌在芐基異喹啉類(lèi)生物堿合成中應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，在芐基異喹啉類(lèi)生物堿合成中，牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶突變體催化牛心果堿的c7羥基甲基化。

7.一種提高氧甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的牛心果堿7-o-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第251位的蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，和?36位纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼?，和將?37位的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種酶活提高的牛心果堿7?O?甲基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用，通過(guò)定點(diǎn)突變的方式，將牛心果堿7?O?甲基轉(zhuǎn)移酶分子內(nèi)部疏水性的氨基酸蛋氨酸胺突變成疏水性強(qiáng)的異亮氨酸，且將疏水強(qiáng)的氨基酸纈氨酸和亮氨酸分別突變成弱疏水性氨基酸蛋氨酸和苯丙氨酸，改變了整體分子內(nèi)部疏水性和底物相互作用，并且重塑了底物口袋腔，顯著提高菌株表達(dá)牛心果堿7?O?甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活性，并將牛心果堿7?O?甲基轉(zhuǎn)移酶活最大提高了約18倍。

技術(shù)研發(fā)人員：開(kāi)國(guó)銀,汪周璐,吳艷婷,李坤倫,馮岳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/29