本發(fā)明屬于植物物種鑒定，具體涉及利用酶切鑒定筒瓣蘭的引物、檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、筒瓣蘭(anthogonium?gracile)隸屬蘭科筒瓣蘭屬，是蘭科植物中兼具觀賞價值和生態(tài)功能的瀕危保護地生蘭花品種。筒瓣蘭中含有氨基酸、糖類、生物堿、黃酮等物質(zhì)，具有藥用研究價值和市場前景。由于筒瓣蘭的經(jīng)濟價值不斷被挖掘出來，人為的干擾及破壞，導(dǎo)致筒瓣蘭野生資源瀕臨滅絕。
2、目前，國內(nèi)外對植物物種資源的檢測鑒定主要通過形態(tài)學(xué)特征進行觀察分析，僅僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定往往很難做出準確的檢測，特別是在植物發(fā)育不完全或只有部分植株材料，以及經(jīng)過加工處理的時候。蘭科植物種類繁多，地理分布較近的種類分子水平的差異較小，設(shè)計出具有特異性的檢測方法，是本領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)難題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供利用酶切鑒定筒瓣蘭的引物、檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用，該檢測方法解決了筒瓣蘭近似種基因序列差異較小，筒瓣蘭特異片段定位困難，容易出現(xiàn)假陽性擴增的技術(shù)難題，從而快速準確地檢測鑒定筒瓣蘭。
2、為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
3、本發(fā)明還提供一種快速鑒定筒瓣蘭的檢測方法，包括：以樣品dna為模板，使用由seq?id?no.1所示的核苷酸序列與seq?id?no.2所示的核苷酸序列組成的引物進行pcr擴增，以限制性內(nèi)切酶對pcr擴增產(chǎn)物進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶數(shù)目和大小鑒定筒瓣蘭。
4、具體的，所述引物包含上游引物seq?id?no.1與下游引物seq?id?no.2，其序列為：
5、上游引物seq?id?no.1序列為：5'-gagaacccgtgaagcaa-3'；
6、下游引物seq?id?no.2序列為：5'-ccaacgaggcgatagca-3'；
7、具體的，所述pcr反應(yīng)體系以25μl計算，包括10×pcr緩沖液(含mg2+)2.5μl、dntp混合物(2.5mmol/l)2μl、taq?dna聚合酶(5u/μl)0.4μl、上游引物seq?id?no.1(10μmol/l)1μl、下游引物seq?id?no.2(10μmol/l)1μl、dna模板1μl、ddh2o17.1μl。
8、其pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、54℃退火45s、72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。
9、具體的，所述的限制性內(nèi)切酶為ecorv。
10、本發(fā)明提供的一種快速鑒定筒瓣蘭的檢測方法，提取待檢植物樣品dna，利用特異序列+引物+內(nèi)切酶的組合位點檢測鑒定筒瓣蘭。本發(fā)明根據(jù)電泳條帶數(shù)目和大小快速鑒定筒瓣蘭，使用特異性引物seq?id?no.1、seq?id?no.2進行pcr擴增，筒瓣蘭擴增出一條大小為481bp的條帶，其它近似種均無擴增產(chǎn)物。同時由于筒瓣蘭的pcr產(chǎn)物中具有ecorv酶切位點，將其酶切電泳后出現(xiàn)兩條條帶，大小分別為265bp和216bp。
11、本發(fā)明還提供了一種快速鑒定筒瓣蘭的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括：上游引物seq?id?no.1，下游引物seq?id?no.2。
12、具體的，所述上游引物seq?id?no.1序列為：5'-gagaacccgt?gaagcaa-3'；
13、下游引物seq?id?no.2序列為：5'-ccaacgaggcgatagca-3'；
14、具體的，所述的限制性內(nèi)切酶為ecorv。
15、本發(fā)明提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果或者優(yōu)點：
16、(1)通過測定蘭科植物的靶標基因序列，序列比對分析筒瓣蘭及其近似種的差異位點，根據(jù)筒瓣蘭靶標基因序列的設(shè)計特異性引物和限制性內(nèi)切酶，解決了筒瓣蘭近似種基因序列差異較小，筒瓣蘭特異片段定位困難的技術(shù)難題，可以有效地區(qū)分筒瓣蘭及其近似種。
17、(2)本發(fā)明根據(jù)筒瓣蘭靶標基因序列的差異性，選取特異區(qū)域進行特異性pcr擴增，進而利用限制性內(nèi)切酶ecorv對gatatc特異性識別酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生的條帶數(shù)目和大小對筒瓣蘭進行鑒定，鑒定準確性高，用于鑒定不同發(fā)育階段的筒瓣蘭。特別是在植物發(fā)育不完全或只有部分植株材料，以及經(jīng)過加工處理的時候，也能做出準確的檢測鑒定。
18、(3)本發(fā)明使用的pcr擴增和酶切技術(shù)均為傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，通過巧妙采用特異序列+引物+內(nèi)切酶的組合位點，操作簡便快捷，相比于基因測序方法更節(jié)省時間，可在一天時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。可實現(xiàn)對筒瓣蘭進行快速、準確地鑒定溯源，且擴增效率高，解決了容易出現(xiàn)假陽性擴增的技術(shù)難題。
1.一種快速鑒定筒瓣蘭的檢測方法，其特征在于，包括：以樣品dna為模板，使用由seqid?no.1所示的核苷酸序列與seq?id?no.2所示的核苷酸序列組成的引物進行pcr擴增，以限制性內(nèi)切酶對pcr擴增產(chǎn)物進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶數(shù)目和大小鑒定筒瓣蘭。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的限制性內(nèi)切酶為ecorv。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，根據(jù)電泳條帶數(shù)目和大小鑒定筒瓣蘭，為根據(jù)265bp和216bp的兩條特異性條帶判定陽性結(jié)果。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的檢測方法在檢測鑒定筒瓣蘭中的應(yīng)用。
5.一種快速鑒定筒瓣蘭的檢測試劑盒，其特征在于，包括：權(quán)利要求1所述的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速鑒定筒瓣蘭的檢測試劑盒，其特征在于，還包括限制性內(nèi)切酶，所述的限制性內(nèi)切酶為ecorv。
7.權(quán)利要求5-6任一項所述的試劑盒在檢測鑒定筒瓣蘭中的應(yīng)用。