本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種利用ptc輔助胃癌患者化療精準(zhǔn)用藥的方法。
背景技術(shù)：
1、胃癌(gastric?carcinoma)是一種常見的消化道腫瘤，起源于胃黏膜上皮。胃癌發(fā)病率位居全球第5位，是惡性腫瘤致死的第3位病因，2019年有超過100萬例胃癌新診斷病例及78.3萬例死亡病例。胃癌的治療手段以手術(shù)為主，放化療為輔。早期胃癌患者通過手術(shù)切除腫瘤組織，術(shù)后輔助放化療，5年生存率可達(dá)95％。晚期胃癌治療以姑息系統(tǒng)化療為主，但治療后中位生存時(shí)間僅為4～8個(gè)月。在胃癌里面使用最多的化療方案包括pf、xelox、tf和df，四種方案均含有5-氟尿嘧啶作為基礎(chǔ)，其中，pf方案(順鉑+5-氟尿嘧啶)和xelox方案(奧沙利鉑+5-氟尿嘧啶)聯(lián)用了鉑類藥物，而tf方案(紫杉醇+5-氟尿嘧啶)和df方案(多西他賽+5-氟尿嘧啶)則聯(lián)用了紫杉類藥物。由于晚期胃癌具有高度異質(zhì)性，導(dǎo)致不同患者的治療療效和預(yù)后存在差異，部分患者治療療效不穩(wěn)定，需要對胃癌患者化療方案進(jìn)行精準(zhǔn)選擇。
2、腫瘤藥敏檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和個(gè)性化醫(yī)療的重要組成部分，對于傳統(tǒng)化療藥物或新型靶向藥物的有效性篩選具有重要作用。不同技術(shù)層面的體外藥敏篩選方法探索了指導(dǎo)臨床實(shí)踐的可行性，包括基于人源腫瘤異種移植瘤模型(patient-derived?xenografts,pdxs)的體外藥敏篩選，體外培養(yǎng)腫瘤類器官進(jìn)行藥敏測試、以及基于體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的藥敏篩選研究。雖然不同的技術(shù)方法已展現(xiàn)各自的優(yōu)勢及相應(yīng)的應(yīng)用前景，但尚未開展大規(guī)模臨床驗(yàn)證及有效性分析，而且各類技術(shù)均尚存不足之處。例如，pdx建模成瘤率低，成瘤周期長，模型建模費(fèi)用高，對于臨床應(yīng)用的指導(dǎo)作用有限；類器官培養(yǎng)成功率及通量相對偏低，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。
3、源于患者的腫瘤樣細(xì)胞簇(patient-derivedtumor-like?cell?cluster,ptc)是一種新興的體外藥敏檢測3d細(xì)胞模型。ptc含有腫瘤細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞組分，與作為來源的患者腫瘤組織樣本在細(xì)胞形態(tài)、病理特征、遺傳變異等方面均具有高度一致性。目前，已經(jīng)成功構(gòu)建乳腺癌患者來源的ptc模型和結(jié)直腸癌患者來源的ptc模型，ptc模型藥敏試驗(yàn)的結(jié)果與臨床一致性達(dá)96.6％。因此，本發(fā)明利用胃癌患者來源的腫瘤樣本構(gòu)建ptc模型，代替患者進(jìn)行體外藥物篩選，在胃癌的精準(zhǔn)化療研究中具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明針對胃癌患者傳統(tǒng)化療存在的不足，開發(fā)了一種利用ptc輔助胃癌患者化療精準(zhǔn)用藥的方法，通過指導(dǎo)胃癌患者的精準(zhǔn)化療，來提升胃癌患者的臨床化療獲益。本方法使用胃癌患者來源的腫瘤樣本構(gòu)建ptc模型，通過對pf、xelox、tf和df等胃癌常用化療方案進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，評估不同藥物組合在體外模型中的效果，為患者的個(gè)體戶精準(zhǔn)醫(yī)療提供支撐。
2、本發(fā)明采用了如下方案：
3、步驟一，收集胃癌患者新鮮腫瘤樣本，進(jìn)行ptc微腫瘤模型的構(gòu)建；
4、步驟二，構(gòu)建的ptc分別與不同的藥物組合共培養(yǎng)168小時(shí)，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；
5、步驟三，藥敏試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)并分析ptc微腫瘤的細(xì)胞活力及在試驗(yàn)前后的面積變化；
6、步驟四，比較同一患者ptc對不同藥物組合的敏感性差異，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)，輔助選擇精準(zhǔn)化療方案。
7、進(jìn)一步地，步驟一中構(gòu)建胃癌ptc的具體方法包括如下步驟：
8、1.1對于腫瘤組織樣本，去除脂肪和壞死組織后通過醫(yī)用剪物理剪切為糜狀，然后加入消化液，在37℃條件下解離；
9、1.2解離完成后，用濾網(wǎng)過濾并收集濾液，離心后用ptc胃癌培養(yǎng)基重懸；
10、1.3將重懸的細(xì)胞按照105cells/cm2的密度接種到胃癌ptc專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使患者來源的腫瘤細(xì)胞與其他組分細(xì)胞自組裝，形成ptc微腫瘤模型。
11、進(jìn)一步地，步驟二中ptc與藥物共培養(yǎng)的具體方法包括如下步驟：
12、2.1ptc微腫瘤模型培養(yǎng)成功后，過濾、離心收集直徑大于40μm的微腫瘤ptc，并用100μl的ptc胃癌培養(yǎng)基重懸并接種，然后加入120μl含不同藥物組合的培養(yǎng)液，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)，每個(gè)藥物組合重復(fù)3次；
13、進(jìn)一步地，步驟三中統(tǒng)計(jì)與分析的具體方法包括如下步驟：
14、3.1在ptc與藥物共培養(yǎng)開始時(shí)，及共培養(yǎng)168小時(shí)結(jié)束后，通過ptc微腫瘤圖像采集分析系統(tǒng)采集ptc面積，比較兩次面積的差異變化pa，評估不同的藥物組合對ptc的效果；
15、3.2在檢測樣品中加入celltiter-glo試劑并混勻，室溫放置20min后用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力，比較不同藥物組合對ptc細(xì)胞活力的影響，評估不同藥物組合對ptc的效果。
16、進(jìn)一步地，步驟1.1中組織樣本如果是手術(shù)或活檢組織，需要20mg以上，如果是穿刺組織，需要三條以上。
17、進(jìn)一步地，步驟1.1中惡性積液樣本需要根據(jù)樣本情況選擇紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂紅。
18、進(jìn)一步地，步驟1.1中消化液內(nèi)的酶為膠原酶i、ii、iv的混合液。
19、進(jìn)一步地，步驟1.1中消化過程需要每隔10min進(jìn)行一次吸打混勻。
20、進(jìn)一步地，步驟2.1中的藥物組合包括pf方案(順鉑+5-氟尿嘧啶)、xelox方案(奧沙利鉑+5-氟尿嘧啶)、tf方案(紫杉醇+5-氟尿嘧啶)和df方案(多西他賽+5-氟尿嘧啶)。
21、進(jìn)一步地，步驟2.1中順鉑、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、紫杉醇和多西他賽的藥物有效濃度分別為：9μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、0.1μmol/l、0.03μmol/l。
22、進(jìn)一步地，步驟3.1中，當(dāng)pa<0.7時(shí)，判讀為ptc藥敏檢測結(jié)果提示該患者可能對該藥物方案敏感。
23、本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
24、本發(fā)明采用基于ptc體外模型的藥敏檢測作為胃癌患者藥物敏感性的評估方式，評估結(jié)果更接近臨床真實(shí)場景下藥物對胃癌的治療效果。通過同時(shí)評估復(fù)數(shù)胃癌常用化療藥物方案，更加直觀的體現(xiàn)不同化療方案對特定患者ptc的敏感性差異，輔助患者精準(zhǔn)選擇化療方案，具有更好的臨床參考價(jià)值。
1.一種利用ptc輔助胃癌患者化療精準(zhǔn)用藥的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟一中的新鮮腫瘤樣本，包括但不限于術(shù)后組織、胃鏡、穿刺等活檢組織以及胸腹水惡性積液樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟一中的ptc微腫瘤模型的構(gòu)建，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胃癌ptc專用培養(yǎng)基，其特征在于，以advanceddmem培養(yǎng)基為基底，添加包括1mm氫離子緩沖劑(hepes)、1×glutamax、100u/ml青霉素-鏈霉素、1×b27、1×非必需氨基酸、40ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(egf)、20ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子(fgf-basic)、500ng/ml?r-spondin?1、100ng/mlnoggin、10mm煙酰酸(nicotinamide)、0.5μma83-01、10μm?sb202190、10μm?rock抑制劑(y-27632-07)、1mm?n-乙酰-l-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、30ng/ml肝細(xì)胞生長因子(hgf)、5ng/mlmsp、10nm前列腺素e-2(prostaglandin?e2)、100mg/ml催產(chǎn)素(primocin)、20μm?chir99021、250ng/mlwnt3a和10nm促胃泌素(gastrin)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，在所述步驟二用于藥敏試驗(yàn)的不同藥物組合為pf、xelox、tf和df方案。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合pf，其特征在于，在與ptc共培養(yǎng)的體系中加入9μmol/l順鉑和2μmol/l?5-氟尿嘧啶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合xelox，其特征在于，在與ptc共培養(yǎng)的體系中加入4μmol/l奧沙利鉑和2μmol/l?5-氟尿嘧啶。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合tf，其特征在于，在與ptc共培養(yǎng)的體系中加入0.1μmol/l紫杉醇和2μmol/l?5-氟尿嘧啶。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合df，其特征在于，在與ptc共培養(yǎng)的體系中加入0.03μmol/l多西他賽和2μmol/l?5-氟尿嘧啶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟三中的統(tǒng)計(jì)并分析，包括以下步驟：
11.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，在所述步驟四中的敏感性差異，是基于加藥前后ptc面積比值pa以及細(xì)胞活力數(shù)值的綜合結(jié)果。