本發(fā)明涉及自動對焦，特別涉及一種基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法。
背景技術：
1、熒光共聚焦和受激輻射顯微鏡是當今生物醫(yī)學研究高分辨成像的重要手段，為了減少光毒性對樣品的影響，使用激光光源功率更低，照射時間更短，普通ccd和cmos對弱熒光信號檢測不靈敏，不適用原子熒光探測技術，而基于雪崩光電二極管的單光子計數(shù)器可以實現(xiàn)對弱光的高靈敏檢測。
2、超分辨成像過程通過激光束在樣本上進行逐點掃描，在每個掃描點上激光激發(fā)樣本中的熒光物質，產(chǎn)生熒光信號，熒光信號通過單光子計數(shù)器進行精確計數(shù)。在焦點處激發(fā)出的熒光信號最強，能最大程度還原實際樣品信息，因此需要對焦得到高質量圖像，但是在高倍物鏡下熒光信號微弱導致手動對焦困難。
技術實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了一種基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，用以解決現(xiàn)有技術中存在的上述問題，即現(xiàn)有技術中超分辨高質量成像手動對焦困難的問題，本發(fā)明提供一種基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，該方法包括：
2、采用光子計數(shù)器獲取多路通道信號，根據(jù)多路通道信號進行單像素成像，確定樣品的灰度圖；
3、通過采用清晰度評價算子與灰度圖進行卷積，得到該位置的清晰度評價值，將當前位置的清晰度評價值與上一位置的清晰度評價值進行比較，將最大值對應的位置作為初步焦點位置，將納米壓電平移臺移動至初步焦點位置；
4、將初步焦點位置作為下一次搜索區(qū)間的中心點，確定目標區(qū)域，采用改進爬山搜索算法，通過逐步縮小納米壓電平移臺的步長、步距以及像素點陣，對目標區(qū)域進行多尺度搜索，依次確定不同步長、步距以及像素點陣對應的搜索位置，采用清晰度評價值設定對前后兩次搜索位置進行比較，以對目標區(qū)域進行調節(jié)，確定最終焦點位置；
5、將納米壓電平移臺從初步焦點位置移動至最終焦點位置，完成自動對焦，獲取樣品的最佳成像位置。
6、可選的，所述通過采用清晰度評價算子與灰度圖進行卷積，得到該位置的清晰度評價值，將當前位置的清晰度評價值與上一位置的清晰度評價值進行比較，將最大值對應的位置作為初步焦點位置，具體包括：
7、通過如下公式得到清晰度評價算子：
8、
9、式中，h為清晰度評價算子，f(x，y)為圖像灰度值，*為卷積運算，si代表各個方向模板；
10、其中：
11、
12、將清晰度評價算子與灰度圖進行卷積計算，得到該位置的清晰度評價值；
13、依次計算灰度圖評價值，將得到的灰度圖評價值進行排序，將最大值對應的位置作為初步焦點位置。
14、可選的，所述樣品的灰度圖的獲取，具體包括：
15、根據(jù)激發(fā)光連續(xù)激光器發(fā)出激光，采用預設的時序對樣品進行逐點掃描，通過單光子計數(shù)器獲取掃描時產(chǎn)生的多路通道信號，得到樣品的灰度圖；其中，所述多路通道信號包括暗噪聲、激光器a熒光信號、激光器a和b熒光信號和激光器b熒光信號。
16、還包括：
17、對所述多路通道信號進行信號去噪和歸一化處理。
18、相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了一種基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，該方法通過不同階段單光子計數(shù)器收集的信號重構圖像，計算清晰度評價函數(shù)，通過改進爬山搜索法，能夠獲取前后兩次清晰度評價值確定步進方向，并通過下一次的評價值判定該階段的焦點位置，驅動壓電平移臺達到目標位置，實現(xiàn)快速準確的熒光超分辨系統(tǒng)的自動對焦；此外，通過多尺度搜索和精細調節(jié)，最大程度還原真實焦點圖像，提高了成像精度。
1.一種基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，其特征在于，包括：
2.如權利要求1所述基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，其特征在于，所述通過采用清晰度評價算子與灰度圖進行卷積，得到該位置的清晰度評價值，將當前位置的清晰度評價值與上一位置的清晰度評價值進行比較，將最大值對應的位置作為初步焦點位置，具體包括：
3.如權利要求1所述基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，其特征在于，所述樣品的灰度圖的獲取，具體包括：
4.如權利要求3所述基于單光子計數(shù)的顯微自動對焦方法，其特征在于，還包括：